病毒分离
1.6 病料处理
采集病猪的小肠，剪碎后转入研磨器中，加入DMEM基础培养液，研磨成10%的组织悬液，反复冻融3次，3000r/min离心10min后取上清，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，置-70℃保存备用。
病猪的粪便用DMEM基础培养液作10倍稀释后加入双抗（终浓度1000IU/ml青霉素、1000µg/ml链霉素）于4℃作用12h，离心取上清，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，置-70℃保存备用。
1.7 RT-PCR扩增PEDV M基因
1.7.1 RNA的提取
取100mg组织样品用剪刀剪碎后，置于研磨器中，加入2ml的DMEM培养基，研磨至组织呈匀浆状，置-70℃冻融2~3次后，5000 r/min离心10 min后，取上清200µl至1.5 ml离心管，每管加入1 ml RNA-Solv® Reagent RNA Isolation Solvent，颠倒混匀，室温静置5~10min。每管加入200 µl氯仿，涡旋15 sec，严格冰浴10 min，4℃ 12,000r/min离心10min。取80%的上清转至新的1.5 ml离心管，加入500 µl异丙醇，混匀，室温静置10min，室温12,000r/min离心10min。弃上清，每管加入1.2ml无水乙醇和300µl DEPC水，轻微涡旋，7500r/min离心5min，弃上清，用枪头吸干残留水份，风干5~10min，最后加入20µl DEPC水溶解。紫外分光光度计测定A260及A280值，确定样品RNA含量及纯度，-70℃保存备用。
1.7.2 反转录合成cDNA
反转录体系按照表1加入。
表1 反转录反应体系
10×RT Buffer
1.0 µl
dNTPs (10mM)
1.0 µl
MgCl2
2.0µl
RNase Inhibitor
0.25 µl
ReverTra AceÒ
0.5 µl
Oligo(dT)20
1.0 µl
RNA模板
适量体积（0.2µg）
RNase Free H2O
加至终体积10.0 µl
反转录的反应程序为：42.0℃反转录30min，95.0℃ 5min，进行反转录。获得的cDNA用作PCR扩增的模板。
1.7.3 PCR扩增
根据GenBank 登录的PEDV(No.JQ282909)基因组序列设计一对特异性引物，扩增PEDV M基因（表2），引物序列为：
上游引物P1：5’－TTCCCGTTGATGAGGTGAT－3’
下游引物P2：5’－AAGCATTGACTGAACGACC－3’
扩增片段大小为552bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
表2 PCR反应体系
10×Ex Buffer
2.5 µl
Ex Taq
0.125 µl
上游引物
0.75µl
下游引物
0.75µl
cDNA模板
5µl
dd H2O
加至终体积25.0 µl
反应条件为：94℃变性5 min后进入循环，循环参数为：94℃ 1min，54℃ 1min，72℃ 1min；35个循环后72℃延伸10min。
取扩增产物在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，观察结果并拍照。
1.8 病毒分离
取经RT-PCR检测为PEDV阳性的病料悬液1ml接种已长成单层的Vero细胞（接种前倒掉细胞培养液，用PBS洗2次），并加入1ml的细胞维持液（含10μg/ml胰酶的无血清DMEM培养液），37℃吸附1h，吸弃接种物，补加5ml的细胞维持液，继续培养，每天观察，如出现细胞病变即及时收毒，如无细胞病变出现，则在培养72h时收毒，并继续盲传，盲传7代后仍无病变者弃去不要。
