荧光定量（qPCR）原理、实验流程及结果分析
一、原理&应用
一）PCR
二）qPCR——化学原理
1.SYBR Green
注：具有结合双链小沟的结构特性，体系中有非特异性扩增时也是可以结合的，所以要保证产物是特异性的
2.TaqMan Probe
TaqMan Probe：20nt（碱基）的寡聚核苷酸，两端有5-发光基团，3-淬灭基团，探针完整时二者距离近不发光。dna外切酶可水解探针，距离变远发光。
注：探针的退火温度要比引物高5-8度。原因：退火时要让探针比引物先结合到模板上，才能被外切酶水解
3.SYBR 对比 TaqMan Probe
三）qPCR——数学原理
no：初始模板量，n：循环次数，N：终产物数量，e：扩增效率；Ct：循环数；k/b：常数
注：实验过程有消耗，实际方程为红色那个
计数方法：仪器给出CT值，带入线性方程计算初始浓度N0
四）应用
二、流程&注意事项
一）流程
1.RNA提取
1）RNA
RNA易降解原因：（1）单链（2）核糖核酸上的羟基（3）RNAase存在于周围环境，反应剧烈
提取原理：（1）尽量不要使RNA降解
2）流程
图：动物细胞/动物组织/植物细胞/血液
- 动物组织更推荐液氮研磨，匀浆会温度升高/遇到内外源性RNAase
- 植物组织有细胞壁更推荐液氮研磨
- 细胞样品简单只需得到细胞沉淀
β-巯基乙醇可变性蛋白释放核酸
Trizol法——沉淀法（传统经典）
胍盐——过柱法
完整RNA三条带：20、88、5，第一条带亮度是第二条的两倍，第三条最浅
中间图条带二最亮——表明RNA部分降解
右边图条带三最亮——表明RNA严重降解，需重新提取RNA
提取关键点
2.逆转录
1）逆转录反应
此过程会加入逆转录酶、引物、BUffer
2）逆转录酶
两种常用酶：M-MLV/AMV均具有RNAase的活性，降低cDNA的完整性，当目的片段十几kb不能选择此酶，更换下表二肽酶/三肽酶
3）逆转录引物
三大类：
1.Oligo dT/锚定Oligo dT
2.随机引物：6个随机碱基的结合，原核生物RNA无poly A尾不能用.Oligo dT/锚定Oligo dT
3.基因特异性引物
原因：在MAP4基因5‘/3’分别设计引物，单独使用Oligo dT得到的CT值有差异（上图），单独使用逆转录出来的cDNA有严重的3‘端偏好，建议使用Oligo dT和随机引物的混合引物
4）金属残留
电泳图单条带上方有一个较大的片段，为金属DNA残留
右图：
绿色：未去除DNA逆转录出
红色：未去除未逆转录，即RNA，不能作为qPCR模板，出现曲线的原因：残留的DNA引起的有污染曲线
黄色：去除DNA逆转录（正确）
黄绿相差3个CT值，建议去除DNA组干扰
3.qPCR
100-200bp时扩增效率才能90%—100%
验证引物的预实验：
将模板梯度稀释——用此引物做pcr——1.熔解曲线：如图窄窄的单峰=扩增特异性强
稀释倍数与CT值做标曲，求斜率带入计算扩增效率的公式
查文献看别人用什么/网站
1.不引入内参：在两组细胞中，提取RNA——逆转录——qpcr——得到CT值和ΔCT——代入公式计算
此实验不严谨：∵保证取RNA——逆转录——qpcr的效率均为一致
2.引入内参：结果相反
先进行预实验
三、结果分析
一）常见图谱&名词
1.校正染料
2.扩增曲线
- 基线期：荧光背景阶段
- 指数增长期：着重关注，方程（n≈n0）此时才适用
- 线性增长期：酶/dNTP不断消耗
- 平台期：
阈值：最低荧光下线的荧光信号
阈值线决定CT值大小
3.熔解曲线
左图解释：PCR反应完成后，仪器升温（60—95℃），此时双链DNA开始解链，荧光信号下降，至某一数值陡降，此时的温度为Tm。
右图：每个锋代表特异性产物，要求溶解曲线单峰，出现杂峰意味着有非特异性的扩增
4.CT值有效性？
1.溶解曲线单峰。如果不是单峰，有非特异性扩增的污染导致曲线上升。
2.复孔间重复性不好
右下粉色图：NTC熔解曲线在目的样本峰形图前有→认为是引物二聚体，可忽略，此时无论CT值多大均不影响数据
右上图：NTC熔解曲线与目的标本的峰图重合→NTC有污染，此时NTC的CT比目的基因大3个或者5个循环才可以用。
NRT的CT比目的基因大3个或者5个循环才可以用。
5.合理设置阈值，放在指数增长期
左图：阈值放在中间，接近于直线的区域
内参中的e相近于1，才可以计算。
e：扩增效率
二）数据处理
1.相对定量
1.绝对定量
标准品很重要，
CDNA不能做标准品原因：浓度不准确
四、F&Q
一）图一
二）图二
基线设置错误/模板浓度过高，基线期一般机器默认，但模板投入过多时默认的基线期不再适合，可手动调整
15调整为10
三）图三
上图：仪器程序设置问题
下图：定期维护矫正
左上：主峰前出现杂峰→引物特异性不好/引物二聚体/引物浓度过高/模板浓度过低
右上：主峰后出现双杂峰→交叉污染/引物特异性差——重新设计引物/对操作环境清洁
左下：Tm＜80℃→扩增片段过短/只有引物二聚体无目的产物——重新设计引物/尝试提高模板浓度退火温度/降低引物浓度/pcr产物电泳检测有无条带确定模板投入是否正确
右下：熔解曲线峰高低
