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Cancer Cell | CD58(LFA-3)缺失通过促进CMTM6上调PDL1抑制抗肿瘤免疫

2023-08-04 09:41 作者:科和生物  | 我要投稿

Cancer Cell | CD58(LFA-3)缺失通过促进CMTM6上调PDL1抑制抗肿瘤免疫

这项研究还是聚焦在肿瘤免疫,分析在免疫检查点治疗中出现抵抗的原因及其机制。过往研究发现在肿瘤细胞中往往会自主降低CD58的表达,而这常与ICB治疗抵抗以及T细胞耗竭相关。但是机制并不清楚。

CD58,有一个另外的名字淋巴细胞粘附因子3(LFA-3),主要表达在抗原提呈细胞上,能够与T细胞CD2结合,而作为第二信号激活T细胞。会进一步作为粘附分子促进效应T细胞的结合。

这项研究在前人信息的基础上,首先通过单细胞测序筛选了并进一步确认了CD58的缺陷与肿瘤免疫逃逸和ICB治疗抵抗相关。进一步分析发现CD58的缺失会一直与T细胞CD2的链接,减少T细胞的激活、抑制肿瘤T细胞浸润以及细胞增殖,同时增加PDL1蛋白来促进免疫逃逸。

为了进一步明确相关机制,作者通过CRISPR-Cas9以及蛋白质组学筛选,确认了CMTM6对于CD58缺失介导的PDL1上调至关重要。CD58和PDL1对于CMTM6结合的竞争确定了他们主要通过内体循环还是通过溶酶体讲解来决定。

总的来说,这项研究明确了CD58缺失通过CMTM6促进PDL1上调而抑制抗肿瘤免疫。

▉结果:

1.肿瘤细胞CD58的表达是抗肿瘤免疫免疫的基础

CD58下调或丢失与癌症免疫逃逸和黑色素瘤ICB治疗抵抗相关;然而,对其基本机制了解不多。利用scRNA-seq对黑色素瘤患者进行了匹配的ICB治疗前和治疗早期的肿瘤活检,以及临床反应数据(图1A)。发现,与无应答者(NR)相比,应答者(R)在基线和治疗过程中CD58上调特征的表达都更高(图1B)。因此,患者的数据表明,癌细胞内在的CD58的表达与有效的抗肿瘤免疫有关。

为了从机制上剖析CD58癌细胞表达在T细胞介导的肿瘤裂解中的作用,我们使用了由黑色素瘤细胞和自体体外扩增的TILs组成的患者源性联合培养物。用CD58基因敲除(KO),然后用CD58-TM或CD58-GPI开放阅读框(ORFs)的过表达(OE)进行拯救,然后进行TIL共培养,产生了其他同源的细胞系。CD58的缺失导致肿瘤裂解和T细胞产生的IFN-ɣ明显减少,而用CD58-TM或CD58-GPI的拯救使癌细胞对T细胞介导的肿瘤杀伤重新敏感,并逆转了IFN-ɣ的产生(图1C、1D)。

为了排除CD58缺失通过非特异性效应赋予免疫规避的可能性,设计了人类外周血单核细胞(PBMCs)来表达一种T细胞受体(TCR),该受体对常见的癌症睾丸抗原NY-ESO-121具有高亲和力,它经常在HLA-A∗2:01等位基因的黑色素瘤中表达和呈现,包括在的一个细胞系模型2686。在这个工程化的联合培养系统中,2686细胞中CD58或B2M(这是MHC I类抗原呈递所必需的)的缺失赋予了对NY-ESO-1-TCR T细胞的抵抗力,从而证实了CD58表型是由特定TCR/表位相互作用介导的。这些结果共同表明,癌细胞表达的CD58通过以TCR特异性/表位素依赖性的方式调节细胞毒性TIL活性来决定肿瘤敏感性。

2.肿瘤细胞CD58的表达以依赖CD2的形式促进了T细胞反应

那么癌细胞自主的CD58表达的免疫调节是否是通过与T细胞上表达的CD2相互作用而发生的。

虽然CD58-TM或CD58-GPI的重新表达逆转了CD58 KO细胞对T细胞共培养的敏感性,但加入CD2-或CD58阻断抗体(但不包括IgG对照)会废除这种重新敏感化。用CD58WT-TM、CD58WT-GPI、CD58K34A-TM或CD58K34A-GPI ORFs拯救CD58 KO细胞,然后与自体TILs或NY-ESO-1-TCR T细胞共同培养。虽然WT CD58构建体的过表达挽救了对TILs杀伤的敏感性和IFN-ɣ的产生,但CD58K34A-TM或CD58K34A-GPI ORFs却没有(图1E)。接下来用CRISPR-Cas9敲除TILs上的CD2,并将WT或CD2 KO TILs与亲代或CD58-TM OE癌细胞共同培养。与WT TILs相比,CD2 KO TILs对亲本或CD58-TM OE细胞表现出最小的细胞毒性(图1F)。

接下来,考虑是否可以通过CD2刺激TILs以增强其细胞毒性活性。使用了重组的CD58-Fc嵌合体同源物,与CD3刺激相结合,足以增加TIL的增殖和体外IL-2的产生,而且明显高于单独的CD3刺激或与CD28刺激相结合。值得注意的是,接受CD58-Fc嵌合体共同刺激的细胞(与仅通过CD3激活的TILs相比)更有效地杀死亲代癌细胞(以及CD58 KO细胞,但程度较低,可能是由于旁观者的细胞因子活动)(图1G)。发现在多个黑色素瘤细胞系上没有CD48的表达,它是一种替代的CD2配体;因此,CD48不太可能在这种情况下发挥重要作用。这些结果表明,完整的CD58-CD2轴对于TIL介导的癌细胞的有效裂解是必要的,而这种特定配体-受体相互作用的破坏会使癌症免疫逃避。

3.CD58的缺失通过抑制肿瘤内T细胞浸润和增殖而抑制抗肿瘤免疫

有效的抗肿瘤免疫和对ICB的反应的一个主要障碍是CD8+T细胞对肿瘤的浸润很差或完全没有。因此试图研究CD58的丢失是否也能损害体内T细胞对肿瘤的浸润。

因为没有已知的CD58的小鼠同源物,用NOG小鼠(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)建立了一个部分人源化的小鼠模型,转基因表达人白细胞介素-2(hIL2)。在这些动物中,将CD58 WT患者来源的黑色素瘤细胞与CD58 KO或CD58-TM OE细胞一起皮下植入双侧腹腔肿瘤,然后用自体TILs(或PBS对照)进行收养性细胞转移(ACT)(图2A)。CD58 KO肿瘤对ACT高度耐受(8只动物中没有反应者),而一半的CD58 WT肿瘤对ACT表现出完全或部分反应(图2B和2C),这表明CD58的丧失在体内驱动免疫逃避。有趣的是,未经治疗的CD58 KO肿瘤比其WT肿瘤生长得更快,这一点以前在体外没有观察到,这表明CD58缺失可能在体内加速肿瘤生长的额外影响。

通过流式细胞仪分析肿瘤的T细胞浸润,发现与CD58 WT肿瘤相比,CD58 KO肿瘤的CD8+TILs浸润低了100倍,这与组织切片的多重免疫荧光(IF)相一致(图2D和2E)。此外,在肿瘤浸润的T细胞中,来自CD58 KO肿瘤的T细胞与来自CD58 WT肿瘤的T细胞相比,增殖率明显降低(图2F)。相反,在CD58-TM OE肿瘤中,T细胞的浸润和随后的增殖都得到了逆转。

为了进一步剖析T细胞浸润的动力学,在ACT后不久(7天)确定了肿瘤携带者(CD58 WT或KO)动物的T细胞丰度。发现在这个早期时间点,CD58 KO肿瘤中的总CD8+和颗粒酶B+CD8+T细胞浸润都有所减少。同样,用CD58阻断抗体治疗的肿瘤动物的T细胞浸润和分化也减少了。这些结果共同表明,癌细胞内在的CD58表达对T细胞早期进入肿瘤和瘤内分化至关重要,与ICB抗性黑色素瘤患者的预测一致。

4.CD58的缺失促进了PDL1的上调抑制了抗肿瘤免疫

CD58的缺失足以促进PD-L1的同时上调,但这种共同调节的基本机制和功能作用仍然未知。

为了解决这个问题,首先使用CD58 KO细胞系,用CD58-TM或CD58-GPI进行逆转,然后进行IFN-ɣ刺激和PD-L1的流式细胞仪或总蛋白评估。虽然CD58缺失导致PD-L1表面和总蛋白丰度增加,但用任何一种CD58异构体救治都会废除同时出现的PD-L1增加,甚至将PD-L1抑制到基线水平以下(图3A-3C)。用K34A突变的CD58 ORFs拯救的CD58 KO细胞也能下调PD-L1的表达,这表明这个CD2结合位点对CD58/PD-L1的共同调控不是必需的。重要的是,MHC I蛋白的细胞表面表达在CD58无效细胞和CD58任一异构体的拯救中都保持不变(图3D),表明对TIL共培养的抵抗和拯救的敏感性都不是由于抗原呈现的改变。

为了确定PD-L1的增加是否有助于CD58损失中的癌症免疫逃避,接下来进行了CD58 KO癌细胞与或不与药物PD-L1阻断的共同培养实验。为此,在体外用抗CD3抗体刺激CD8+自体TILs,产生PD-1+TILs。当与PD-1+TILs在抗PD-L1阻断抗体存在下共同培养时,CD58 KO黑色素瘤细胞表现出对TIL介导的杀伤的敏感性增加,而对照细胞仍不受影响(图3E)。因此,CD58缺失时PD-L1表达升高有助于免疫规避,增加了CD58缺失或下调可能导致ICB抵抗的机制。

5.基因组规模的CRISPR-Cas9筛选确定CMTM6为CD58的正向调节器

为了开始剖析CD58/PD-L1共调控的机制,首先寻求确定CD58的调节器。首先,进行了全基因组CRISPR-Cas9功能缺失筛选,结合荧光激活细胞分选(FACS)(图4A)。与对照组中表达CD58的细胞(CD58mi)相比,有11个基因靶点在CD58lo细胞内被持续富集(图4B、4C)。正如预期的那样,这个筛选中最重要的 "命中 "是敲除CD58本身;其他预期的命中包括PIGV和PGAP2,它们都参与GPI锚的形成,进一步证实了这个筛选的稳健性。有趣的是,名列前茅的是CMTM6,它最近被描述为PD-L1维护的一个重要调节器。

6.CMTM6通过内体循环与CD58结合并促进其蛋白质的稳定性

值得注意的是,在CRISPR-Cas9或IP-MS筛选中,没有发现CD58和PD-L1之间有直接的遗传或蛋白质相互作用,这表明它们的共同调节是由另一个媒介控制的。由于CMTM6被提名为跨屏幕的CD58的调节器,并考虑到其参与PD-L1表面蛋白的维护,选择进一步研究其作为这样一个潜在调节器的作用。

首先,验证了CMTM6在用于IP-MS的蛋白裂解液中与CD58共同免疫沉淀(图5B)。其次,产生了CMTM6 KO黑色素瘤细胞系,并显示CMTM6的缺失导致多个模型中CD58和PD-L1表面和总蛋白丰度与其他同源对照相比下降(图5C-5E)。用CMTM6 ORF拯救CMTM6 KO足以恢复蛋白CD58和PD-L1的表达。相反,CD58的mRNA水平不受CMTM6扰动的影响,表明CMTM6在蛋白水平而不是转录水平上调节CD58(图5F)。

鉴于CMTM6在穿梭PD-L1到回收内体中的作用,接下来调查了CD58和CMTM6的亚细胞定位。在中频共聚焦成像中,CD58与CMTM6在回收内体(以转铁蛋白受体(TfR)的表达为标志)和细胞膜上都有共聚焦(图5G)。此外,已知CMTM6将PD-L1运送到循环内体,以防止其在溶酶体中降解,因此推断CMTM6可能会类似地调节CD58。事实上,在基于流式细胞仪的降解试验中,我们发现CD58和PD-L1,但不是MHC I类,在CMTM6 KO中的降解率比同源亲代细胞高,而且这种降解可以被溶酶体抑制剂所限制(图5H)。接下来,使用黑色素瘤异种移植和患者肿瘤(原发性和转移性黑色素瘤病变)的接近结扎试验(PLA),明CMTM6和CD58在原位保持密切的物理接近(图5I-5K)。因此与稳定PD-L1相似,CMTM6与CD58结合并促进其从细胞表面回收到内体,从而防止其溶酶体降解。与这一发现相一致的是,我们在CRISPR-Cas9 KO筛选中发现的CD58的另一个正向调节因子是DNAJC13,其编码的蛋白在介导膜从早期内体到回收内体的贩运中起作用。

随之作者证实了CMTM6对于在CD58缺失中促进PDL1的表达中发挥重要作用,进一步证实了CMTM6介导的细胞外循环对于CD58或者PDL1的结合是十分重要的。


Refrence:

1.The CD58-CD2 axis is co-regulated with PD-L1 via CMTM6 and shapes anti-tumor immunity


小编:阿羽

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