泛素特异性蛋白酶21通过充当Fra-1去泛素酶促进结直肠癌转移

写在前面

        今天推荐的是由成均馆大学医学院在2020年1月14日发表于Cancers（2020IF：6.639，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Kyeong Kyu Kim教授，研究表明泛素特异性蛋白酶21通过充当Fra-1去泛素酶促进结直肠癌转移。

研究背景

        Fos-related-antigen-1(Fra-1)是激活蛋白-1（AP-1）转录因子超家族的成员，在癌症的进展和转移中具有重要作用，Fra-1被认为是转移性癌症包括转移性结直肠癌（mCRC）的治疗目标。然而，其在蛋白质水平上的调节功能尚未清楚阐明。

摘要部分

        作者发现泛素特异性蛋白酶21(USP21)通过去泛素化Fra-1来增加Fra-1的稳定性，并增强结肠癌细胞中Fra-1靶基因的表达。作者还表明USP21控制依赖Fra-1的迁移和入侵活动。当USP21敲低的癌细胞被脾内注射到小鼠体内时，USP21的致癌特性通过肝转移的显着减少得到证实。一致地，结直肠癌患者的临床病理学分析揭示了USP21表达与高级别癌和寿命的相关性。这些结果表明USP21通过去泛素化Fra-1来增强Fra-1稳定性和AP-1靶基因表达。因此，USP21被认为是具有高Fra-1表达的mCRC的有前景的治疗靶点。

研究内容

1.USP21结合并调节Fra-1表达

        作者筛选了在293T细胞中增强AP-1荧光素酶报告基因活性的DUB。研究发现USP21可以导致AP-1转录活性和Fra-1表达的最大增强。因此，作者假设USP21是Fra-1DUB，并进一步研究了其在调节Fra-1表达中的作用。为了研究USP21影响AP-1转录活性的分子机制，定量了结肠癌中Fra-1的蛋白质表达水平。首先，作者在两种结肠癌细胞系HCT116和HT-29中确定了USP21在USP21敲低条件下对稳定Fra-1的影响。siUSP21以剂量依赖性方式显着降低Fra-1蛋白。为了进一步研究USP21是否与Fra-1相互作用，作者在293T细胞中进行了免疫沉淀。该结果表明USP21和Fra-1之间存在相互的相互作用。

研究结论：USP21结合并调节Fra-1表达。

2.Fra-1蛋白被蛋白酶体降解     

        为了确定Fra-1稳定性是否受泛素化依赖性蛋白酶体途径的负向控制，作者探究了用蛋白酶体抑制剂MG-132处理后HCT116细胞中Fra-1的蛋白质降解。总细胞裂解物的分析显示Fra-1蛋白的时间依赖性、连续积累。此外，为了研究Fra-1稳定性是否受DUB依赖性去泛素化正调控，将编码USP21的质粒转染到HCT16细胞中。与缺乏MG-132处理的细胞相比，USP21的异位表达进一步增加了Fra-1的表达。

        为了检查MG-132和USP21对Fra-1的影响，作者接下来通过免疫染色观察了Fra-1蛋白的细胞分布。Fra-1存在于细胞核中，但在MG-132处理后也分布在细胞质中。与Fra-1相反，USP21蛋白出现在细胞质中。

研究结论：Fra-1蛋白被蛋白酶体降解。

3.USP21用作Fra-1DUB

        为了研究USP21的催化活性是否影响Fra-1的稳定性，构建了编码突变体USP21 (C221A)的质粒构建体，该突变体缺乏催化活性。接下来，为了确定USP21是否通过其酶活性促进Fra-1的去泛素化，作者探究了总细胞裂解物和来自不同293T的Fra-1免疫沉淀（IP）样品中泛素化(Ub)的程度。WT USP21的过表达导致总细胞裂解物中泛素化蛋白的减少。然而，C221A USP21的过度表达并没有改变泛素化水平。与这一观察结果一致，siRNA对USP21表达的降低促进了Fra-1的泛素化，而加入WT USP21可以逆转这种情况。这些结果表明Fra-1是USP21的底物，其稳定性受泛素化控制。一致地，在放线菌酮(CHX)存在下，HCT116细胞中的USP21过表达明显增加了Fra-1蛋白的半衰期。

研究结论：USP21是结肠癌细胞中Fra-1蛋白质稳定性所必需的，研究表明USP21是Fra-1的DUB。

4.USP21调节Fra-1介导的转录活性     

        作者使用结肠癌细胞中的荧光素酶报告基因检测了USP21对Fra-1依赖性AP-1转录活性的影响。与WT USP21过表达的影响相反，USP21敲低显着降低了AP-1转录活性。然而，WT USP21与USP21敲低细胞的互补导致AP-1转录活性的恢复。

        作者通过测量MMP-1的表达来研究USP21对Fra-1活性的影响，MMP-1是Fra-1的靶基因，因为AP-1与MMP-1启动子结合。作者通过对Fra-1转染后的MMP-1启动子进行荧光素酶检测，并在USP21敲低后测量USP21对Fra-1活性的影响。USP21敲低明显降低了Fra-1活性。作者还在相同条件下通过定量实时PCR分析测量了MMP-1mRNA表达。当Fra-1诱导MMP-1表达时，USP21敲低降低了Fra-1对MMP-1表达的影响。相反，USP21敲低细胞中USP21的过表达增强了MMP-1的表达。通过蛋白印迹发现，siUSP21降低了Fra-1的蛋白质表达，但用USP21基因转染恢复了Fra-1表达。为了比较WT和突变体(C221A) USP21之间的差异，作者分析了Fra-1介导的转录活性。与AP-1荧光素酶报告基因检测结果一致，作者发现突变体USP21对MMP-1启动子活性或MMP-1的mRNA水平没有影响。总之，这些结果证实了在这些条件下Fra-1蛋白水平增强，并且USP21的催化活性稳定了Fra-1蛋白。然而，USP21过表达对Fra-1基因表达没有显着差异。

研究结论：USP21通过增加Fra-1蛋白的表达水平来促进Fra-1介导的MMP-1表达。

5.USP21与结肠癌细胞的侵袭和迁移活动有关

        Fra-1在结肠癌中的表达水平与细胞迁移和侵袭密切相关。因此，作者探究了USP21对结肠癌细胞HCT116和HT29中迁移和侵袭活性的影响。首先，作者验证了Fra-1表达增强了迁移活动。首先，作者验证了Fra-1的表达增强了迁移活性。然后，作者比较了Fra-1与USP21或siUSP21共同表达Fra-1的迁移活性。作者发现USP21显着增加了癌细胞的迁移活性，并且USP21敲低减少了细胞迁移。一致地，癌细胞的侵袭活性被USP21显着诱导，而USP21敲低降低了Fra-1效应。作者还证实Fra-1水平也与癌细胞迁移和入侵能力成正比。

研究结论：USP21通过控制Fra-1活性与结肠癌细胞的侵袭和迁移相关。

6.USP21表达在结直肠癌组织中上调并与不良预后相关

        为了进一步证实USP21在结直肠癌中的作用，使用免疫组织化学检查了297名结直肠癌(CRC)患者样本中USP21的表达，并分析了与临床病理参数的相关性。USP21在患者肿瘤样本中的表达由免疫组织化学(IHC)评分表示。与正常细胞和腺瘤细胞相比，结直肠腺癌细胞中的USP21表达显着增强。CRC患者样本中USP21表达的IHC图像也说明了USP21表达与癌症分期之间的相关性。此外，与早期阶段相比，第4阶段结直肠癌中的USP21水平显着增加。有趣的是，在具有频繁淋巴结转移和大量内淋巴肿瘤栓子的结直肠癌中，USP21表达显着提高。与这些发现一致，结直肠癌细胞中USP21的表达与不良预后显着相关。

研究结论：USP21在结直肠癌发展和癌症转移中的致癌作用。

7.USP21对体内转移的影响

        由于这项研究表明USP21与结肠癌中增强的迁移和侵袭活性相关，作者探究了USP21对小鼠模型中癌细胞转移能力的影响。将对照组WT HCT116和实验组USP21敲低HCT116脾内注射裸鼠中，然后进行脾切除术。磁共振成像(MRI)每周监测每组的肝转移率，注射后第14天确认对照组的肝转移。在第23天处死小鼠并对其肿瘤进行表征。两组均在肝脏中发现转移性肿瘤。然而，USP21敲低实验组中的肿瘤更小且数量较少，如肿瘤形成区域的百分比所示。该结果与USP21敲低细胞的迁移和侵袭活性降低一致。这些结果表明USP21有助于癌细胞的迁移和转移。为了进一步证实USP21对肿瘤进展的促进作用，通过免疫组织化学检查了来自对照组和实验组的肿瘤组织中USP21和Fra-1的表达水平。该分析表明，相对于对照组，HCT116-shUSP21实验组的Fra-1水平显着降低。

研究结论：USP21的表达升高与结肠癌转移有关。

结论与讨论

        以前，作者通过监测转染DUB编码质粒后泛素化蛋白总量来筛选在293T细胞中表现出强去泛素化活性的DUB。这一过程导致鉴定出20个属于USP亚家族的DUB。在测试的DUB中，作者新发现USP21作为Fra-1 DUB在CRC中发挥致癌作用，并调节参与癌症转移的Fra-1靶基因。此外，本研究表明，使用小鼠模型，uSP21敲低可减少体内肿瘤形成和癌症转移，并且USP21表达在结直肠癌患者中上调。最后，作者建议将USP21下调作为mCRC的潜在治疗策略。

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原文链接:https://www.mdpi.com/2072-6694/12/1/207