Angew Chem：超快速循环标记技术用于单细胞中多目标荧光成像

       大家好，今天和大家分享一篇近期刚被 Angewandte Chemie International Edition 接收的工作： “ Ultra-fast cycling for multiplexed cellular fluorescence imaging”。这篇文章的通讯作者是哈佛医学院和麻省总医院的 Ralph Weissleder 教授。Weissleder 教授课题组长期从事细胞生物学研究及影像学诊断，近年来的研究聚焦于细胞体内显微成像，生物正交小分子体内显像剂， 纳米级核磁共振实时传感。 近年来， 他们基于四嗪（ tetrazine， Tz）和反式环辛烯（ trans-cyclooctene， TCO）这一生物正交反应对开展了一系列工作。Tz 类生物正交化学于 2008 年报道后，其异常高效的动力学和高度可功能化等特性吸引了许多生物医学研究者的兴趣。这这篇工作中， Weissleder 教授课题组基于 TCO 和 Tz 分别构建了荧光标签和猝灭剂，用于单细胞荧光成像及荧光信号的快速猝灭。
      细针针吸细胞学（ fine needle aspiration， FNA）是一种微创的临床检查方法，最常用于癌症检查中。FNA 通过对体表或深部脏器的肿物抽取细胞（每次抽取 1000 个细胞以内）进行诊断，并通过染色和成像对被抽取细胞进行分析。对于荧光方法来说，由于单次检测的荧光标记数局限于 4-6 种，不足以进行癌细胞的深度鉴定，因此，通常会利用单细胞循环标记技术实现同一细胞样本中更多标志物的分析。大部分荧光循环标记技术通过去标记或光漂白去除标记物或标记信号，通常需要较为极端的反应条件，如强碱性的条件（ pH > 12）用于光漂白，并不适用于少量细胞样本的分析。同时，这些基于化学键断裂或光漂白的循环标记过程十分复杂且耗时。与化学键断裂或光漂白的思路不同，本文中作者以基于 Click 反应的荧光猝灭为循环标记基础，设计了能够快速、高效、温和地实现单细胞循环标记的方法。借助高效的 TCO 和 Tz 生物正交反应，该技术 1 s 以内，即能够实现超快速的荧光猝灭；1 h 内，能够通过多轮标记实现理论上实现 20-30 种标志物的成像分析。
      作者首先合成了一系列结构如图 1A 所示的具有 TCO 结构及荧光发色团的荧光标
签（ FAST probes）。该结构中赖氨酸作为连接臂：赖氨酸的羧基与 TCO 的 3’相连，用于保持反式烯烃的结构稳定性；一端氨基与荧光发色团相连；另一端氨基通过(PEG)4 连接 N-羟基琥珀酰亚胺用于与抗体连接。同时，合成了如图 1B 所示的具有 Tz 结构以及BHQ3 猝灭基团的猝灭剂（ BHQ3-Tz）。该结构中通过设计(PEG)5 连接臂用于增加 Tz 的水溶性，且不影响猝灭效果。BHQ3-Tz 对于常用荧光标签，如 AF488， AF594， AF647，OG488， AF532， IR750 等均具有较好的猝灭能力（猝灭效率均大于 90%）。为实现荧光猝灭信号定量，作者进一步证实各种 FAST probes 均能对抗体高效标记，标记后的抗体均能被 BHQ3-Tz 猝灭。FAST647-labeled anti-EGFR 在加入 BHQ3-Tz 后猝灭了超过 99%荧光信号。猝灭后的荧光信号在生理条件下（PBS， pH = 7.4），即使 4 小时后荧光信号也没有明显反弹（<5%）。证明了荧光猝灭的高重现性、高效性和高稳定性。

      作者还发现这种基于 Click 反应的猝灭反应速度非常快。根据单纯的 Tz-TCO Click

反应的动力学速率常数 k = 7200 M-1s-1，理论上猝灭反应的时间应为 5 min。而实际上，猝灭反应在 10 s 内即能完成（图 2A），猝灭反应半衰期 t1/2小于 0.5 s（图 2B），这种猝灭反应的速度比单纯的 Click 反应还要快速。因此，作者进一步对基于 Tz-TCO Click 反应的猝灭动力学性能进行探究。作者研究了 FAST probes 标记抗体与 BHQ3-Tz 的反应速率曲线，其反应速率呈现明显的二级反应特点。经计算， AF488 体系猝灭反应的二级反应速率常数为 7.4x106 M-1s-1，比 Click 反应的速率常数加速了约 1000 倍；AF488 体系猝灭反应的二级反应速率常数为 2.7x107 M-1s-1，比 Click 反应的速率常数加速了超过3300 倍。这种反应加速即使在高浓度 BSA 蛋白体系及细胞培养基体系中仍十分明显，且几乎不受体系中高蛋白浓度的影响。作者猜测， 这种相比于 Click 反应的进一步加速，与荧光团-BHQ3 之间原本存在的亲和力有关，但单独的荧光团-BHQ3 结合是一个快速转换的可逆过程，因此在缺少 Click 反应条件下，两者无法观察到明显的荧光猝灭。TzTCO click 反应与荧光团-BHQ3 亲和关系协同加速了猝灭反应。

      作者将 FAST-probe 标记抗体与 BHQ3-Tz 猝灭剂用于小鼠结肠癌细胞的循环标记成像研究中，关注了细胞中 12 种免疫标志物（CD45， CD8， CD3， CD4， PD-1， CD11b，F4/80， MHCII， CD163， CD206， Ly6G， CD11c）。细胞分析流程如下：相关细胞均由FNA 技术取样获得，取样后的细胞清洗后制成细胞涂片；染色前先对细胞进行固定和通透，并用 1% BSA-PBS 封闭；小鼠结肠癌细胞分析中，每批次标记 3 种无干扰性标记抗体，并加入 DAPI 染色用于细胞定位，抗体等标签与细胞孵育 15-30 min 后用于成像分析；成像后加入 BHQ3-Tz 猝灭剂清洗细胞（10 s 内完成）；循环标记-成像-猝灭过程，12 种免疫标志物通过 4 轮标记-成像完成（图 3A）。CD45 作为免疫细胞的主要标志物在第一轮标记中用于筛选出 CD45+DAPI+免疫细胞。借助 Cell Profiler 细胞成像分析软件，作者在 11 个成像区域筛选出 1846 个 CD45+免疫细胞用于进一步分析。在这些细胞中，进一步鉴定区分出 CD8+ T 细胞， CD4+ T 细胞，巨噬细胞，树突状细胞，中性粒细胞等多种细胞类型（图 3B）。

      综上，作者发展了一种超快速、高效率的循环标记方法用于单细胞荧光成像分析。基于四嗪 Tz 和反式环辛烯 TCO 的 Click 反应设计并合成了能够实现快速猝灭的抗体荧光标签及猝灭剂，其猝灭反应的半衰期小于 0.5 s，比理论估算值快 3 个数量级。作者将它应用于 FNA 技术抽取的少量细胞样品体系，通过 4 轮标记实现了 12 种标志物的成像分析，且整个循环标记和成像过程均能在 1h 左右完成。这种快速高效的分析方法对于癌症诊断治疗及肿瘤微环境研究具有重要意义。

原文献连接：https://doi.org/10.1002/anie.201915153