直播回顾｜基因编辑敲入细胞模型构建的挑战和解决方案问答集锦
赛业生物细胞基因编辑生产经理范丽莉为大家带来了「基因编辑敲入细胞模型构建的挑战和解决方案」线上课程，在最后的答疑环节，大家提出了许多困扰已久的问题，就让云课堂小助理带大家一起回顾一下这些精彩问答吧！
Q：请问基因敲入相比起基因敲除的难点在哪里？
A：
原理：CRISPR-Cas9基因编辑利用Cas9和sgRNA切割基因组形成DSB，哺乳动物细胞主要利用NHEJ和HDR两条保守途径修复DSB。这两条修复途径相互竞争，大部分DSB通常由NHEJ修复。而基因敲除通过NHEJ通路，基因敲入通过HDR通路。从机制上来说，基因敲入比基因敲除更加困难。
方案设计：基因敲入需要确保外源基因准确地插入目标位点，需要精确的设计gRNA和donor，而基因敲除的gRNA可选择的范围就比较广。
递送策略：基因敲入需要将gRNA，Cas9和donor都递送到细胞内，需要选择更优的递送策略才能获得更高的效率。
克隆筛选和鉴定：由于基因敲入的效率普遍较低，挑取的克隆数相对较多，鉴定的工作量也会相应增加。
Q：α-donor提升HDR的原理是什么？
A：
关于α-donor提升HDR，我们主要从以下3个方面做了改进和优化：
优化同源臂设计，选择最优的gRNA和Donor序列；
优化递送策略；
优化转染方法。
Q：肿瘤细胞和IPSC细胞构建的细胞模型和小鼠模型，主要不同点是什么？
A：
肿瘤细胞模型操作简便，构建成本低，周期短，可进行高通量筛选，具有人类遗传背景，能很好地模拟疾病模型。缺点是无法模拟动物的生理环境。
IPSC细胞模型细胞除了具有无限增殖能力，高通量筛选和人类的遗传背景，还具有产生各种类型细胞的能力。对于研究稀少或难以分离的细胞类型（例如神经元或心肌细胞），可通过重编程技术将成体细胞（常用外周血）重编程获得IPSC细胞，进行相应的基因编辑，再分化成特定的细胞来作为疾病模型。对于突变较多的疾病类型，可选择从病人身上抽血重编程成IPSC细胞再分化成特定的细胞或者类器官，这样的疾病模型就拥有了病人身上的所有突变，能更好地模拟该种疾病。这一点无论是肿瘤细胞还是动物都比较难实现的。其缺点也是无法模拟动物的生理环境。
动物模型能够模拟环境效应和个体在生命周期内的反应，研究体内系统的相互作用、细胞类型、组织和整个动物系统之间的相互作用。但动物模型构建周期长，无法高通量筛选。遗传背景与人类不同，在代谢、免疫系统、行为学方面存在差异。动物与人的各方面差异使得筛选药物在临床转化方面存在极大挑战。
Q：出现可变剪切需要重新设计SgRNA吗？出现这种情况怎么处理？
A：
出现可变剪切不一定需要重新设计设计gRNA。如果有如下的选择可以不用重新设计gRNA。
筛选到的阳性克隆>1且有不同突变类型的克隆，可以选择其他突变类型克隆来避免可变剪切；
gRNA设计在不同外显子上，可通过选择不同外显子上面的单克隆来避免出现可变剪切的问题。
Q：请老师介绍一下HepG2细胞挑克隆法？
A：
HepG2细胞挑克隆法需要先将细胞稀释到非常低的密度种到培养皿里，培养一定时间，根据克隆团形成情况挑取合适的克隆团到96孔板中继续培养。
Q：怎么构建IPSC的基因敲入和敲除细胞？
A：
构建IPSC的基因敲入目前还是比较困难的，技术壁垒和对平台的要求都比较高。如何构建IPSC的基因敲入和敲除细胞，需要注意以下几个细节：
培养条件苛刻，编辑过程容易分化，失去干性，合适培养的条件及丰富的细胞培养经验至关重要；
选择最优的基因敲入和敲除方案设计；
IPSC细胞对转染较敏感，需要摸索适合的转染方案确保高转染效率和活率；
IPSC细胞易成团生长，分成单个细胞比较难生长，需要摸索出适合的单克隆制备方法和条件。
