细胞骨架的荧光观察----细胞生物学实验

实验目的

1.  了解荧光探针的基本知识

2．学习荧光显微镜的工作原理及使用方法

3.  掌握细胞核和微丝骨架的标记技术

实验原理

细胞骨架：细胞骨架是真核细胞中由蛋白质聚合而成的三维的纤维状网架体系。细胞骨架包括微丝、微管和中间纤维。细胞骨架在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用。

鬼笔环肽是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反,只与聚合的微丝结合,而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后,抑制了微丝的解体,因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。DAPI是一种能与DNA特异性结合的荧光探针，所以被大量用于活细胞的观察和定量的研究。

实验器材

荧光显微镜、载玻片、盖片、滴管、滤纸、35mm细胞培养皿

PBS缓冲液、0.5% Triton X-100、4%多聚甲醛、DAPI储存液

55nM Alex-phalloidin（鬼笔环肽）

实验步骤

1.  将细胞置于小盖玻片上，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中于37℃, 5%CO2培养箱中培养至细胞融合度达70%～80%。

2.  取出培养有细胞的小盖玻片，置于小平皿中用37℃预温 PBS轻轻漂洗3次。

3.  加入37℃预温4%多聚甲醛固定15min 。

4.  用37℃预温PBS漂洗3次。

5.  加入0.5 % Triton X-100通透处理约10min。

6.  用37℃预温PBS漂洗3次。

7.  取一个洁净的载玻片，按照载玻片的大小在其上放置一条封口膜，在封口膜上滴加10ul 55nM Alexa-568-phalloidin (绿)，将经上述处理的盖玻片细胞面向下孵育于染色液中，室温避光染色30min。

8.  小心取下盖玻片，将其置于小平皿中（细胞生长的面朝上），用37℃预温PBS避光漂洗3次。

9.  在载玻片上分别滴加DAPI工作液10ul，将盖玻片上的细胞倒扣在载玻片上室温暗处孵育10 min。

10.  封片。

11.  荧光显微镜观察微丝（蓝色荧光激发，产生绿色荧光）；核（紫外光激发，产生蓝色荧光）。

实验结果

思考题

1、0.5%Triton X-100处理细胞的作用是什么？

0.5%Triton X-100处理细胞的作用是溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，增加细胞膜的通透性，使荧光染料能够更容易地透过细胞膜与F-actin特异性结合。

2、鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优缺点是什么？

（1）鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优点：鬼笔环肽的分子量小，很容易通过细胞，不需要对细胞进行冷丙酮和TRITON X-100处理。鬼笔环肽可以与聚合的微丝结合，通过让这种毒素吸附于荧光染料上面，可以研究细胞的内部工作机制，窥视细胞如何分裂。

（2）鬼笔环肽用于细胞骨架研究的缺点：对细胞有毒性，价格昂贵。