USP22在肝细胞癌中上调ZEB1介导的VEGFA转录-AbMole科研快报

肝细胞癌（HCC）是一种常见的实体肿瘤，复发率高，死亡率高。最近，发现一种新的VEGFA调控因子将有助于更好地了解HCC的进展和抗血管生成治疗的耐药性。泛素特异性蛋白酶22（USP22）作为一种去泛素化酶，参与多种肿瘤的生物学过程。而USP22影响血管生成的分子机制仍有待进一步研究。

AbMole（http://www.abmole.cn/）精研抑制剂十年，最新的科研动态不断与您分享。

在这里，我们的结果表明USP22作为VEGFA转录的共激活剂。重要的是，USP22通过其去泛素酶活性参与维持ZEB1的稳定性。USP22被招募到VEGFA启动子上的ZEB1结合元件上，从而改变组蛋白H2Bub水平，增强ZEB1介导的VEGFA转录。USP22缺失降低细胞增殖、迁移、血管拟态（VM）形成和血管生成。

结果还表明，敲除USP22可以抑制荷瘤裸鼠肝癌的生长。此外，在临床HCC样本中USP22的表达与ZEB1的表达呈正相关。因此，USP22通过上调VEGFA的转录促进了HCC进展，这为HCC抗血管生成药物耐药提供了一个新的治疗靶点。

VEGFA-165（Abmole，M9413，纯度>95%）是一种强有力的生长和血管生成细胞因子。

https://www.abmole.cn/products/recombinant-human-vegf165.html

为了进一步研究USP22对HCC进展的影响，我们首先通过慢病毒感染稳定敲除USP22 （shUSP22）的Huh7细胞和PLC/PRF/5细胞，并以打乱shRNA作为对照（shCtrl）。western blotting实验验证了USP22的敲除效率。采用MTS实验和细胞集落形成实验研究USP22对肝癌细胞增殖的影响。结果显示，USP22缺失显著抑制了细胞增殖（图5A）。被抑制的细胞增殖通过重组人蛋白VEGFA-165处理部分恢复，这是一种主要的亚型，具有与天然VEGFA密切对应的特性（图5B, C）。数据表明，USP22在HCC细胞中促进细胞增殖，USP22对细胞生长的影响部分与VEGFA有关。

我们观察到USP22的下调导致HCC细胞形态萎缩，细胞间黏附增强，细胞集落之间难以形成联系（图5D）。这些结果提示USP22可能参与了HCC细胞的基质重塑或运动。血管生成拟态（VM）描述了侵袭性癌细胞通过变形和基质重塑形成新生血管网络的可塑性。因此，采用试管形成实验研究USP22对HCCLM3细胞诱导的VM形成的影响。结果显示，USP22缺失显著抑制了管状网络的形成（图5E）。这些结果表明，USP22的表达可能促进了HCC来源细胞系中VM的形成。

接下来，为了确定USP22对HCC细胞迁移和侵袭行为的影响，我们在shUSP22 Huh7或shUSP22 PLC/PRF/5细胞中进行transwell实验。我们的数据表明，USP22的缺失抑制了HCC细胞的迁移和侵袭（图5F, G）。为了进一步研究USP22对血管生成的潜在影响，我们首先采用ELISA法检测Huh7细胞培养上清中VEGFA的水平。结果表明，USP22缺失抑制了VEGFA的分泌（图5H）。从shUSP22或shCtrl Huh7细胞中收集条件培养基，体外进行HUVEC管形成实验。结果表明，在shUSP22 Huh7细胞的条件培养基中，HUVEC细胞之间的细胞间连接减少（图5I）。在条件培养基中培养的HUVEC集落形成实验表明，在shUSP22 Huh7细胞的条件培养基中，HUVEC的增殖也减少（图5J）。这些数据表明，USP22促进HCC血管生成部分与VEGFA的表达有关。综上所述，结果表明USP22参与了HCC的增殖、侵袭、VM形成和血管生成。

为了研究USP22在小鼠肝癌生长中的作用，在小鼠异种移植模型中进行了肿瘤生长分析。如图6A-D所示，来自shUSP22 HCCLM3细胞的肿瘤比来自shCtrl细胞的肿瘤体积更小，生长速度更慢。shUSP22肿瘤形成的血管比对照组细。注射VEGFA-165可部分恢复USP22下调对肿瘤生长的抑制作用。然后检测了USP22、VEGFA和ZEB1在这些异种移植瘤中的表达。

结果表明，USP22的下调降低了VEGFA mRNA或蛋白的表达。而USP22的缺失会降低ZEB1蛋白，而不是降低mRNA水平（图6E, F）。此外，USP22在异种移植瘤中的表达也与VEGFA的表达呈正相关。为了测试ZEB1在我们的模型中的作用，用慢病毒构建了稳定过表达USP22的HCC细胞。将对照组和USP22过表达组的HCCLM3细胞皮下注射入BALB/c裸鼠进行异种移植实验。

2周后，当肿瘤大小约为100 mm3时，将携带usp22过表达的肿瘤细胞随机分为两组：在肿瘤中注射ZEB1 siRNA（7.5 μg），另一组每72 h注射等量的阴性对照，持续2周。结果显示，过表达USP22可显著促进HCC的生长，而敲低ZEB1则抑制了USP22对肿瘤生长的作用（图6G-J），说明ZEB1参与了HCC的发生发展，USP22促进HCC生长与ZEB1有一定的关系。

免疫组化结果显示，USP22缺失降低了异种移植瘤中USP22、ZEB1或VEGFA的表达。周期性酸-希夫（PAS）染色常用来指示糖原或多糖（紫红色）的存在，以获取肿瘤血管浸润的可能性。采用CD31和PAS双染色方法区分VM富含基质的形态模式。VM结构为肿瘤细胞排列的血管样通道，PAS阳性/CD31阴性染色（PAS + CD31-），PAS +和CD31 +染色部分为内皮血管。数据显示，与shCtrl肿瘤相比，shUSP22中VM（PAS + CD31-染色）的数量较少，这表明抑制USP22可能会抑制VM的形成（图7A）。

综上所述，结果表明USP22促进小鼠HCC细胞生长和VM形成。在揭示了USP22维持了ZEB1的稳定性后，接下来用免疫组化的方法检测了24对人HCC病理切片中USP22和ZEB1的表达。结果显示USP22在HCC中的表达与ZEB1的表达呈正相关（图7B）。这些结果表明USP22/ZEB1/VEGFA促进了HCC的进展。

鸣谢：Kai Zeng, et al. Cell Death Dis. 2023 Mar 11;14(3):194.