项目文章 | Cell Death Differ：范先群教授团队发现 circRNA 促进骨修复新机制

前言

2020 年 8月，上海交通大学医学院附属第九人民医院范先群教授、谷平教授为共同通讯作者，在 Cell Death & Differentiation (IF: 10.717) 发表了题为“CircRNA-vgll3 promotes osteogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells via modulating miRNA-dependent integrin α5 expression”的研究论文，报道了 circRNA-vgll3 调控脂肪间充质干细胞成骨分化的分子机制。

张丹丹博士为第一作者。文章中 circRNA 测序和分析由欧易生物协助完成。

研究背景

骨再生修复领域种子细胞问题一直未能得到很好的解决。由于来源广泛和容易获得，脂肪来源的间充质干细胞（ADSC）成为骨再生医学中主要的种子细胞之一，然而有限的成骨分化能力阻碍了其在骨缺损修复中的临床应用潜能。

越来越多的证据表明，circRNA 参与了干细胞/祖细胞的命运决定，但它们在干细胞/祖细胞成骨中的具体作用仍鲜见报道。本研究重点关注 ADSC 成骨分化中 circRNA 的作用机制。

研究内容

本研究表明，来源于 vgll3 基因座的 circRNA-vgll3 显著增强了脂肪干细胞的成骨分化；沉默 circRNA-vgll3 则显著降低 ADSCs 的成骨能力。研究表明，circRNA-vgll3 通过 circRNA-vgll3/miR-326-5p/整合素α5 (Itga5) 途径在 ADSC 成骨中起作用：Itga5 促进 ADSC 成骨分化，miR-326-5p 抑制 Itga5 翻译，CircRNA-vgll3 在细胞质中可以直接吸附 miR-326-5p 并抑制其活性以促进成骨分化。

此外，对 circRNA-vgll3 修饰的 ADSCs 复合 CPC 支架在修复大鼠标准骨缺损模型中的安全性和有效性进行了系统评价，结果表明 circRNA-vgll3 能增加骨矿物质密度、骨小梁数量与新骨体积，显著促进骨缺损的修复。

研究结果

1. ADSCs 中 circRNA-vgll3 的特征

从大鼠体内分离脂肪间充质干细胞 ADSCs，利用 BMP2 对 ADSCs 进行成骨分化诱导，然后对诱导/非诱导的 ADSC 进行 circRNA 测序。按照来源于外显子、表达量 RPM > 0.1、有 miRNA 靶位点的标准，共筛选出 11 个 circRNA（图 a）。其中 circRNA-vgll3 来自于已报道的间充质干细胞成骨和成脂分化决定基因 vgll3 的第 3 个外显子（图 c）。

利用反向引物、Sanger 测序、RNaseR 处理、放线菌素 D 处理证实 circRNA-vgll3 确实具有 circRNA 特性（图 d-h）。

RT-PCR 显示，circRNA-vgll3 表达量在 BMP2 诱导的 ADSC 成骨分化中逐渐上升，在骨组织发育中也明显上升（图 i-j）。核质分离和 FISH 实验表明，circRNA-vgll3 主要分布于细胞质中（图 k-n）。

2. circRNA-vgll3 正向调控 ADSC 的成骨分化

在 ADSC 中过表达 circRNA-vgll3，RT-PCR 和 WB 检测显示成骨 marker 基因均显著上调（图 c-e）；ALP 和 ARS 染色显示 circRNA-vgll3 过表达促进了 ALP 活性和钙沉积（图 f-i），这都是成骨分化的标志。knockdown circRNA-vgll3 则会引起相反的变化趋势。以上结果表明 circRNA-vgll3可以促进 ADSC 的成骨分化能力。

3. miR-326-5p 通过靶向 Itga5 调控 ADSC 的成骨分化

分析显示 circRNA-vgll3 上具有两个 miR-326-5p 的靶向位点。RT-PCR 显示在 BMP2 诱导的 ADSC 成骨分化过程中 miR-326-5p 表达量下调（图 a）。

RT-PCR 和 WB 检测在 ADSC 中过表达 miR-326-5p 导致成骨 marker 基因均显著下降；knockdown miR-326-5p 则导致相反的变化（图 d-e），表明 miR-326-5p 可以抑制ADSC 的成骨分化能力。

进一步研究 miR-326-5p 所靶向的 mRNA，靶基因预测软件显示它可以靶向 213 个 mRNA（图 g）；上述 BMP2 诱导的 ADSC 转录组测序数据显示，其中只有 Itga5、CRY2、Mapk3 基因隶属于 ADSC 成骨相关 KEGG 通路中。在 ADSC 中过表达/knockdown miR-326-5p，只有 Itga5 表达量发生显著改变，并且在成骨分化的 0、2、5、7 天呈现时间依赖性变化（图 h-j）。荧光素酶报告实验证实 miR-326-5p 可以直接靶向结合到 Itga5 的 3’-UTR 区域（图 n-o）。

并且抑制 Itga5 表达，同样会导致成骨 marker 基因的表达下调（图 p-q）。以上结果表明miR-326-5p 可以通过靶向 Itga5 调控 ADSC 的成骨分化。

4. CircRNA-vgll3 通过 miR-326-5p 上调 Itga5 的表达

circRNA-vgll3 上具有 miR-326-5p 的 2 个靶向结合位点，荧光素酶报告实验证明 miR-326-5p 可以通过这 2 个位点直接结合 circRNA-vgll3（图 a-b）。利用靶向 circRNA-vgll3 的探针进行 RNA pull down，RT-PCR 显示探针可以显著富集 circRNA-vgll3 和 miR-326-5p（图 c-d）。利用靶向 Ago2 蛋白的抗体进行 RIP 实验，RT-PCR 显示可以显著富集 circRNA-vgll3 和 miR-326-5p（图 e-g）。FISH 显示 circRNA-vgll3 和 miR-326-5p 也共同定位于细胞质中（图 h-i）。

ADSCs 中成骨 marker 基因和 Itga5 基因在 circRNA-vgll3 knockdown 时会显著下调，但同时 knockdown miR-326-5p 又会得以恢复（图 j-k）。如果同时过表达 circRNA-vgll3 和 knockdown Itga5，会抑制由 circRNA-vgll3 过表达所引起的 成骨 marker 基因的上调（图 l）。综合以上结果表明，circRNA-vgll3 可以通过 miR-326-5p 上调 Itga5 的表达，进而发挥其促进 ADSC 成骨分化的作用。

5. circRNA-vgll3 调节体内骨形成

为了研究 circRNA-vgll3 在体内的作用，对 circRNA-vgll3 修饰的 ADSCs 复合 CPC 支架在修复大鼠标准骨缺损模型中的安全性和有效性进行了系统评价。结果显示过表达 circRNA-vgll3 的 ADSCs，能明显增加骨矿物质密度、骨小梁数量与新骨体积，显著促进骨缺损的修复。

研究结论

本研究报道了 circRNA-vgll3 调控脂肪间充质干细胞成骨分化的分子机制：circRNA-vgll3 在细胞质中直接吸附 miR-326-5p 以抑制其活性，使受到 miR-326-5p 所靶向抑制的 Itga5 蛋白表达水平上升，进而促进脂肪间充质干细胞的成骨分化。本研究揭示了 circRNA-vgll3 在新骨形成中的重要作用与机制，为临床上骨缺损修复难题的解决提供了新思路。

参考文献

Zhang D, Ni N, Wang Y, et al. CircRNA-vgll3 promotes osteogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells via modulating miRNA-dependent integrin α5 expression. Cell Death & Differentiation 2020; doi:10.1038/s41418-020-0600-6.

说明：本文源自欧易生物微信公众号