混合克隆“进阶版”-单克隆细胞株如何获取？

前面几期，小编对慢病毒感染细胞的全流程进行了详细介绍，本期内容小编与大家分享单克隆细胞株构建方式。什么是单克隆细胞株呢？我们一般将感染后经过筛选的细胞称为稳转株，也就是混合克隆细胞株。混合克隆细胞株虽然可以表达目的片段，但不同克隆（细胞）的目的基因整合位置和表达量均有所不同。另外由于不同细胞克隆的增殖速度不同：阴性细胞＞目的基因表达量较低的阳性细胞＞表达量较高的阳性细胞。因此一般在混合克隆细胞株传代的10代左右会观察到表达量逐渐下降，最后高表达量的细胞消失，得到由低/中等表达量的细胞组成的混合克隆细胞株。而单克隆细胞株是从混合克隆细胞中经单个细胞增殖所得，即由同一个细胞扩增得到的细胞株。每个细胞的目的基因整合位置以及表达量等特征均高度一致。

一般情况下，混合克隆稳转株即可满足科研需求，比如基因功能初步验证等实验，节省了单克隆化的时间与经济成本。但与单克隆株相比，以此得出的数据稳定性与重复性往往稍差，若想减少实验的波动，提高实验的可重复性，则需要挑选单克隆细胞株。

构建单克隆细胞株前需要预先对实验细胞进行评估，主要为两个方面：1、细胞类型，构建过程至少需要实验细胞增殖10代以上，最好选择商品化的细胞株作为实验细胞。2、细胞克隆形成率，指细胞在极低密度条件下的生长能力，一般细胞克隆形成率＞10%的实验细胞有较大可能获得单克隆。

实验室常用的单克隆细胞株挑选方式有三种：

一、有限稀释法，采用梯度稀释原则，将细胞悬液连续倍数稀释至极低密度，接种于96孔板，直至孔中出现单个细胞克隆。简单易操作，但整个培养过程比较耗时。具体步骤如下：

l单细胞悬液制备：取对数生长期的细胞，用胰酶消化，制成单细胞悬液；

l细胞计数：取少量细胞悬液，用台盼蓝染色后对活细胞进行计数；

l细胞梯度稀释：将细胞悬液移至刻度离心管中连续倍数稀释，稀释至5～10个细胞/mL；

l细胞接种：将稀释好的细胞悬液分别接种于96孔板中，放入培养箱内培养；

l单克隆标记：细胞贴壁后，在倒置显微镜下观察培养板各孔的细胞数，标记只含一个细胞的细胞孔，继续培养，培养期间，视培养液pH值的变化决定是否更换培养液；

l扩大培养：待单细胞群落生长至孔底面积的1/3或1/2时，将细胞克隆转移至24孔板中扩大培养。

二、平皿克隆分离法，通过在平皿内预置小盖玻片或用金属套环并加消化液达到分离克隆细胞的目的。

l单细胞悬液制备：取对数生长期的细胞，用胰酶消化，制成单细胞悬液；

l细胞计数：取细胞悬液，用台盼蓝染色后对活细胞进行计数；

l细胞梯度稀释：通过稀释将细胞密度调整至每5ml培养液含50-250个细胞；

l克隆化培养：将细胞悬液转移入直径60mm的平皿内，培养8-15天；

l分离克隆与扩大培养：套环法，镜下观察克隆形成情况，标记单个细胞克隆→移去培养液，用无菌镊子取金属套环并在一端涂少量无菌硅脂→利用金属套环圈住一个单克隆细胞群落，并在其中加入少量胰酶→将消化的单克隆细胞群落转移到合适的培养皿中（24或6孔板），扩大培养。玻片法，接种细胞前在直径为60nm的平皿中预先分散放置一定数量的无菌小玻片→入细胞悬液，隔天观察并标记只含一个细胞的玻片→培养一段时间后，用无菌镊子夹出长成单克隆细胞群落的玻片并转移至24孔板中扩大培养。

三、软琼脂克隆分离法，适用于悬浮细胞。

l接种：将稀释好的单细胞悬液接种至铺有软琼脂的培养皿中培养；

l观察：镜下观察单克隆细胞群落出现的情况；

l扩大培养：镜下用毛细吸管吸取单个细胞克隆群落，移入小试管中吹打，使细胞从琼脂中释放。将含克隆细胞的培养液转移至合适的培养皿中扩大培养。

实验室常用的单克隆稳转细胞株构建方式分享到此结束，供大家参考。汉恒专营工具病毒十余载，如有病毒需求或有相关问题欢迎随时咨询。