基因工程—目的基因的筛选与获取【选必三】|0基础救星！
喵喵 | 5-3 目的基因的筛选与获取
1️⃣基因工程基本操作概述
基因工程的基本操作程序：
- 目的基因的筛选与获取
- 基因表达载体的构建
- 将目的基因导入受体细胞
- 目的基因的检测与鉴定
- 目的基因的定义及结构
（1）目的基因的定义及种类
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，
如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。例如培育转基因抗虫棉的目的基因——Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因。
编码区：能够转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成的区段。
非编码区：在编码区的上游和下游，不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质的区段。有调控遗传信息表达的核苷酸序列，主要包括启动子（含RNA聚合酶的结合序列）、终止子等。
【提问】
调控转录（基因非编码区）
- 启动子、终止子
调控翻译（mRNA）
- 起始密码子、终止密码子
例题1
下列有关基因结构的叙述，正确的是
A. 真核细胞的基因中，编码区中的内含子不编码蛋白质✓
B. 原核细胞的基因中，不包含非编码区
C. 非编码区是两个基因之间没有遗传效应的区段【非编码区指的是基因内部上游、下游、启动子、终止子，算是基因的结构；没有遗传效应的是基因和基因之间的非基因序列】
D. 终止子是翻译终止的信号，阻碍RNA聚合酶的移动【转录】
2. 筛选合适的目的基因
随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank），序列对比工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，所以从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
3. 目的基因的获取方法
根据目的基因的有关信息，获取目的基因。
从细胞中分离目的基因
- 直接从供体生物细胞中分离目的基因（原核）
- 方法一
- 从基因文库中分离目的基因（真核）
- 方法二
人工合成目的基因
- 化学合成法（目的基因序列完全已知）
- 方法三
- PCR（DNA片段序列完全已知或至少其两端20bp左右序列已知以便设计引物）
- 方法四
- 反转录法：常用RT（反转录）—PCR法
- 方法五
【方法一：直接从供体生物细胞中分离目的基因】
最常用的方法是：“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。
适用对象：从简单的基因组中分离目的基因，如原核基因、质粒或病毒。
具体操作：用限制酶将供体细胞的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在受体细胞中大量复制（即扩增），从中找出含有目的基因的细胞（菌落原位杂交法、基因产物检测法等）。
【方法二：从基因文库中分离目的基因】
基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。
分为基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库）
【注意】
- 真核生物基因一般从cDNA文库获取。
- 如果想获得胰岛素基因，不能从胰岛A细胞cDNA文库中获取?
例题2
利用人胰岛B细胞构建cDNA文库，然后通过核酸分子杂交技术从中筛选目的基因，筛选过程如下图所示。下列说法错误的是
A. cDNA文库的构建需要用到逆转录酶【mRNA→cDNA】
B. 图中的菌落是通过稀释涂布法获得的【确实比较均匀】
C. 核酸分子杂交的原理是碱基互补配对
D. 从该文库中可筛选到胰高血糖素基因【cDNA文库中的胰岛B细胞中，没有胰高血糖素基因】
例题3
下列关于基因文库的说法中，不正确的是
A. 某果蝇X染色体上的所有基因组成的文库是部分基因文库
B. cDNA文库中的基因可以在不同物种间进行交流【cDNA文库没有内含子】
C. 取出果蝇某细胞中全部mRNA，通过反转录产生的全部DNA片段称该果蝇的基因组文库【反转录得到的是cDNA文库】
D. 可以根据基因的碱基序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因
【方法三：化学合成法】
- 适用对象：长度短且碱基序列已知的DNA的合成例如，合成PCR的引物、基因探针、人工接头等。
- 根据已知的氨基酸序列合成DNA：
蛋白质的氨基酸序列 —推测→ mRNA的核苷酸序列 ―推测→ 目的基因化学核苷酸序列 —化学合成→ 目的基因
【方法四：利用PCR获取和扩增目的基因】
- 前提：DNA片段序列完全已知或至少其两端20bp左右序列已知以便设计引物
- 过程：90℃以上（变性）→50℃左右（复性）→72℃左右（延伸）
- 条件：模板DNA，dNTP，引物，TaqDNA聚合酶，缓冲液，Mg²⁺。
- 扩增DNA检测方法：琼脂糖凝胶电泳
【方法五：RT（反转录）—PCR法】
mRNA —逆转录酶→ 互补DNA（cDNA）—DNA聚合酶→ 双链DNA（即目的基因）
