尴尬了，实验验证和数据分析结果不一致，怎么办？

大家做完测序分析之后，一般都会做个简单的qPCR验证一下，但是结果不符合预期，尤其是结果存在不一致的情况，尴尬了，该怎么办呢？小编作为资深科研党，被很多人问过类似问题。

下面，小编根据收到的问题做了归类梳理，大家看看能否解答心中的疑惑。也欢迎大家留言评论自己遇到的科研问题，小编会定期答复，大家一起进步啊！

1 qPCR验证与RNA-Seq测序结果不一致，为什么？

两种方法之间本身就存在差异，具体如下：

第一：两者实验上存在差异。qPCR选择的目的基因的扩增区域、扩增效率、qPCR试剂等原因均会影响最终的表达量结果；RNA-Seq测序可能存在的GC偏好等也会影响最终的表达量结果。

第二：数据分析上存在差异。由于RNA测序经历了建库、测序和信息分析等复杂的过程，各种参数的改变通常会造成结果的差异。不同的数据库，最后检测到的基因和junction数目都不相同。这也可以部分解释，有些老师用同样的数据，在不同公司进行分析，得出不同的结果。

所以使用qPCR验证的RNA-Seq定量结果，由于两种技术本身的差异及表达量计算原理的差异，所以建议关注两种基因表达的检测结果变化趋势总体是不是一致，具体表达量的值及差异倍数数据作为参考。

2 qPCR验证与RNA-Seq测序结果上下调不一致，怎么办？

 先检查是否存在以下这几种情况：样本对比关系弄反了、做验证的基因表达量偏低、没有用测序的样本来做验证等。这些都是比较常见的导致验证结果上下调不一致的原因。

 如果大部分基因都验证上了，只有少数基因不一致，那其实是很正常的现象。我们来看2015年BMC Genomics杂志的一篇RNA测序的文章的验证结果（Zhang W, Chen J, et al., Comparative transcriptomic analysis of immune responses of the migratory locust, Locusta migratoria, to challenge by the fungal insect pathogen, Metarhizium acridum. BMC Genomics. 2015 Oct 26;16(1):867.），这篇文章中验证的58个基因，有50个qPCR和RNA-Seq测序结果一致，一致性是86.2%，这个结果对于杂志来说，通常是可以接受的。

3 所筛选基因全部都验证不一致，怎么办？

如果以上问题都不存在，您挑选的基因全部都验证不一致，那就拿起电话打给测序公司吧，得看一下数据分析是不是有问题。

好啦，困惑解答完毕~

祝大家年年行大运，多发文章多中基金，没事儿多来看看小编呀~