过表达载体！无缝克隆引物设计就用TaKaRa，3分钟搞定一个方案！
以pEGFP-C1构建human p53 CDS过表达载体为例
1.与传统的酶切连接一致的，我们先获取插入片段以及载体的序列信息。
1）Nucleotide: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/
NCBI获取基因序列（fasta）
获取第一转录本CDS序列
经TA克隆的目标基因序列直接使用测序结果进入下一步
2）SnapGene：http://www.snapgene.com/resources/plasmid_files
SnapGene获取载体图谱序列
2.TaKaRa In-Fusion引物设计工具
在无缝克隆的过程中，最重要的就是需要设计一对合适的引物
1）打开TaKaRa官网：https://www.takarabiomed.com.cn/
选择解决方案，点击多能手In-Fusion的高级应用
2）页面底端选择In-Fusion工具箱
3）进入页面后，选择In-Fusion引物设计工具
4）引物设计：https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tools
5）在左侧选择需要设置参数
①选择项目类型：克隆/突变
②输入载体序列
③选择载体线性化的方式，通常我们会选择酶切的线性化方式
选择酶切后会提示输入限制性内切酶
④输入插入片段
6）点击生成引物，新弹出的页面中会出现进行无缝克隆融合后的载体图谱，右侧是它的序列。
7）加载开放阅读框视图，检查目标序列与GFP标签是否融合
①找到GFP阅读框
②找到p53阅读框
③目标序列起始密码与GFP不同框
④融合域出现GFP终止密码，这是不允许的
因此说明，这个无缝克隆构建的方式，是没有将目标序列比较好的融合到载体中。
8）返回上个设置参数页面，将插入片段中与GFP标签不能同框多余的碱基A去除后，重复之前的引物筛选。
查读码框是否融合，目标基因读码框是否移位
我们可以看到，在同一个读码框下，GFP标签和目标序列完成了融合。
9）下拉后，可以看到用于执行克隆的引物序列
标黄部分指引物中所存在的序列
选择下载结果
10）解压下载结果
打开表格CSV格式文件
两条序列的信息、引物序列、TM值等等
就用TaKaRa网站，完成了引物设计。
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