4步套路快速了解干湿结合分析A基因通过B通路调控非肿瘤机制研究设计
哈喽，大家好，小薇又跟大家见面啦~ 今天小薇给大家分享点干货，怎么样分析单基因通过某信号通路来调控非肿瘤疾病的机制研究设计，这样的套路学会了应用面很广哈。那小薇就以下面这篇文献为例，4步教会大家怎么样设计“干湿结合分析单基因通过信号通路调控非肿瘤机制”实验，一起跟着小薇往下看看吧~
第一步：TOP2A在反复自然流产（RSA）中的表达情况
首先，作者分析了在RSA组织样本中TOP2A的表达情况，免疫组织化学显示，TOP2A定位于绒毛组织的核质中，RSA患者的TOP2A表达显著低于对照组（P<0.001）（图1A）。WB分析显示，与正常组相比，RSA患者绒毛中TOP2A蛋白的表达减少（P<0.01）（图1B），这与qRT-PCR分析的结果一致（P<0.01）（图1C）。总之，这些结果表明，与对照组相比，RSA患者的绒毛中TOP2A表达降低。
第二步：研究TOP2A对滋养层细胞的功能影响
为了进一步研究TOP2A在RSA中的作用，评估了TOP2A蛋白在滋养层细胞系中的表达，包括JEG-3、HTR8/Svneo细胞。将靶向TOP2A sh-RNA和TOP2A过表达质粒分别转染到JEG-3和HTR8细胞中，以产生TOP2A敲低（sh-TOP2A）和TOP2A过度表达（OE-TOP2A）细胞。WB和qRT-PCR检测敲低和过表达的效率（P<0.05）（图2A，B和3A，B）。WB分析显示，与sh-NC组相比，sh-TOP2A组的TOP2A表达下降（P<0.001），这与qRT-PCR分析结果一致（P<0.05）。此外，OE-TOP2A组HTR8细胞中TOP2A蛋白水平是载体组的1.3倍，这与qRT-PCR结果一致（P<0.05）。TOP2A敲低显著降低了EDU标记的细胞被标记的比例，表明细胞增殖下调（图2E）。
凋亡相关蛋白cleaved-caspase3在sh-TOP2A JEG-3细胞中的表达增加（P<0.05），而在OE-TOP2A
HTR8/Sveno
细胞中表达减少（P<0.01）。Pro-caspase3不受TOP2A敲低或过表达的影响（图2C和3D）。qRT-PCR分析表明，与sh-NC组相比，sh-TOP2A组中增殖相关基因Ki67下调（P<0.05），促凋亡基因bim、bax和caspase7上调（P<0.05）；而在OE-TOP2A中观察到相反的结果（P<0.05）（图2D和3C）。利用流式细胞仪检测细胞凋亡率，结果发现与载体转染细胞相比，TOP2A的过表达降低了细胞凋亡率（P＜0.0001），而在sh-TOP2A组中观察到相反的结果（P＜0.001）（图2G和3E）。TUNEL测定中的荧光强度也支持这些发现（图2F）。
利用流式细胞术来分析TOP2A表达失调对细胞周期的影响（图2H和3F）。TOP2A过表达在HTR8细胞中导致S期细胞百分比显著增加（P<0.05）。而TOP2A下调在JEG-3细胞中导致G1期阻滞（P<0.001）。至于G2期，TOP2A敲低组和质粒转染组没有观察到差异。
Transwell和伤口愈合测定用于进一步研究TOP2A是否可以影响JEG-3细胞的侵袭和迁移。如图4所示，与sh-NC组相比，sh-TOP2A组的侵袭和迁移细胞数量显著减少（P<0.05）。接着通过qRT-PCR和WB来评估TOP2A对侵袭能力的影响，发现与sh-NC组相比，sh-TOP2A组中促进侵袭的MMP-2和MMP-9的表达降低（P<0.01）（图4D，E）。因此，表明TOP2A对迁移和侵袭具有积极作用。
总之，这些结果表明，缺乏TOP2A可能会导致早期胎盘浅层植入，这在一定程度上会导致RSA。
第三步：分析TOP2A涉及RSA的潜在机制
接着为了分析TOP2A涉及RSA的潜在机制，对sh-NC和sh-TOP2A组进行RNA测序，以确定TOP2A相关基因和下游信号转导途径的变化。结果发现在sh-NC和sh-TOP2A组共鉴定出1764个差异表达基因，包括798个上调基因和966个下调基因（图5A、B）。利用富集分析用于分析TOP2A相关通路（图5C-E），发现这些基因主要富集的通路包括FOXO信号通路、细胞凋亡和mTOR信号通路。
为了进一步研究TOP2A是否通过FOXO信号通路介导其功能，测量了FOXO信号通路相关蛋白和基因的表达。结果发现与sh-NC组相比，敲低TOP2A降低了sh-TOP2A组中p-FoxO1、p-FoxO3a和p-Rb的水平（P<0.05）（图6A）。此外，使用qRT-PCR评估细胞周期相关基因的表达，包括Foxo1、cyclinD3、p27和CDK6（P<0.05）（图6C），所得到的结果也与预测相符。数据显示，TOP2A通过调节FOXO信号通路中蛋白质的磷酸化来调节细胞增殖和凋亡。为了进一步证实这些发现，使用HTR8细胞系来验证下游信号分子的表达。在OE-TOP2A组中，与NC组相比p-FoxO1、p-FoxO3a、CDK4、CDK6和cyclinE1的表达显著上调（P<0.05）。一致地，qRT-PCR分析显示，在OE-TOP2A组中，CyclinD1、CDK4和CDK6的mRNA表达上调，其中与P18、P21和P27的mRNA表达显著下调一样（P<0.05）。总之，这些发现表明，TOP2A在JEG-3和HTR8细胞增殖、凋亡和细胞周期中的调节作用可能与FOXO信号通路有关。
为了证实TOP2A通过调节FOXO信号通路在介导细胞功能中的作用，使用了一种特异性FoxO1抑制剂AS1842856来抑制FOXO通路。如图6B所示，经TOP2A敲除并用FoxO1抑制剂处理的JEG-3细胞显示p-FoxO1表达增加，这表明增殖恢复（p<0.05）。此外，qRT-PCR分析显示，与sh-TOP2A组相比，sh-TOP2A联合 AS1842856治疗组中CDK抑制剂（包括p18、p21、p27和Bim）的mRNA表达降低，而CDK4、CDK6和Cyclin D1的mRNA表达显著增加（P<0.05）（图6D）。因此，在一定程度上抑制FOXO信号通路可以挽救TOP2A敲低引起的增殖和凋亡的减少。
第四步：体内实验验证TOP2A的作用
图7A显示了用于获得和处理植入前胚胎的方案。为了进一步阐明TOP2A在小鼠胚胎发育和滋养外胚层分化中的作用，在含有选择性TOP2A抑制剂PluriSIn的培养基中培养了两个细胞胚胎。结果，在PluriSIn2处理组中，胚胎发育率显著降低（图7C）。如图7D（P<0.001），PluriSIn2处理组的滋养外胚层分化低于对照组。
据报道，ZGA相关基因的下调与早期小鼠胚胎发育障碍有关。因此，进行了qRT-PCR分析，以评估PluriSIn2是否可以通过下调ZGA相关基因来降低胚胎质量。如图7E，在处理组或未处理组中，基因SCAN4B（Zscan4b）、Eif1a、热休克因子1等的mRNA表达没有观察到统计学差异。
接下来，研究了TOP2A的抑制是否会导致ROS的积累，进而导致胚胎发育迟缓。为了探索PluriSIn2介导的TOP2A抑制作用的机制，使用共聚焦激光扫描显微镜检测胚胎中线粒体超氧化物（反映ROS水平的指标）。如图7F所示，用PluriSIn2处理的四细胞胚胎的线粒体超氧化物水平显著高于对照胚胎（P<0.05）。鉴于ROS的积累会损害线粒体膜的通透性，对JC-1进行了染色，以比较PluriSIn2处理组和未处理组的荧光强度。与对照组相比，用PluriSIn2孵育的胚胎显示出显著增加的绿色荧光，这表明线粒体膜电位降低（P<0.05）（图7G）。
最后利用一张图来帮大家串一下文章的主要研究内容吧~ 简单四步，先分析单基因在疾病中的表达，接着在体外分析单基因在疾病中的作用，然后测序分析其涉及的机制，最后在体内实验中进行进一步验证。
好啦，今天小薇就给大家分享到这里啦，其实这样的套路可应用还是很多的，你get到啦嘛？有问题的小伙伴可以留言哈~ 没有研究方向的小伙伴也不要着急，小薇这里还提供实验设计服务，有需要的小伙伴随时联系小薇，小薇一直都在~
