8.4分生信非肿瘤文章，免疫浸润+机器学习+模型验证。

2023-02-01 22:18 作者:275276 0人读过 | 我要投稿

冠状动脉疾病中筛选诊断生物标志物和治疗靶标的鉴定，并和免疫浸润关联

Identification of diagnostic biomarkers and therapeutic targets in peripheral immune landscape from coronary artery disease

结果

外周血中差异mRNA表达的鉴定

本研究涉及 199 名 CAD 患者和 218 名对照者的外周血转录组。PCA 分析表明，批次效应在三个基因组中被有效去除。共鉴定出 762 个 DEG，其中 396 个基因上调，366 个基因下调。上调前五位的基因是C17orf78、TTTY21、TMEM213、COL21A1和SNX31，而下调前五位的基因是EGR3、TTTY7、TMEM196、DNAJC28和OLR1。热图显示 CAD 患者和对照组之间 |logFC| > 0.2 的基因，表明它们可能参与了 CAD 的病理过程

DEG 的识别。一个。GSE20680、GSE20681和GSE42148在批次效应移除和校正之前的 PCA 聚类图。乙。PCA 聚类图显示批次效应已被消除。C. _ CAD 和控件之间 DEG 的火山图。D. _ CAD 和健康样本之间前 17 个 DEG 的热图。红色：上调；绿色：下调

DEG 的功能富集分析

为了探索这些 DEG 与调节过程中涉及的生物学功能之间的关系，我们构建了蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络。PPI 分析显示这些基因在蛋白质水平上有很强的联系。。GO 分析揭示了分别涉及分子功能、生物过程和细胞成分的 DEG 的概况，例如受体-配体活性、转运蛋白复合物和细胞过程。 KEGG通路富集图显示，主要富集的通路是细胞因子-细胞因子受体相互作用、神经活性配体-受体相互作用和IL-17信号通路，表明与炎症反应和神经活动相关的功能有很强的相关性。

筛选出的差异基因的功能富集分析。一个。蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络构建以揭示不同基因之间在蛋白质水平上的相互作用。乙。基因本体论 (GO) 分析条形图显示了 BP、CC 和 MF 过程中 DEG 的富集。C. _ KEGG-基因分析图显示，DEGs主要集中在5个免疫相关信号通路上，其中最多的是细胞因子-细胞因子受体相互作用（Size = 20）

DE-IRGs测定和免疫相关细胞景观分析

CAD 患者的上述 DEGs 与 IRGs 重叠。确定了 CAD 患者的 58 个 DE-IRG。同时，发现这些芯片中7种免疫细胞亚群的比例与CAD组不同。其中，CAD中活化的树突状细胞、肥大细胞、中性粒细胞、Th17细胞和MDSC的比例升高（P < 0.05），而活化的B细胞和CD56杀伤细胞的比例降低（P < 0.05）。此外，变化的外周免疫细胞之间存在相关性（，如活化的CD4 + T细胞/Th2细胞(r = 0.62)、巨噬细胞/肥大细胞(r = 0.55)、中性粒细胞/浆细胞样树突状细胞(r = 0.62)。

免疫相关基因和相应的免疫细胞亚群。一个。CAD 中 58 个 DE-IRG 的维恩图。乙。显示 CAD 中主要 28 种免疫细胞变化的热图。红色：上调；绿色：下调。C. _ CAD组（红色）和对照组（蓝色）之间上述免疫细胞富集评分差异的箱线图。D. _ 28种免疫细胞的相关气泡图。彩色气泡的大小代表相关强度。红色：正相关；蓝色：负相关。气泡越大越暗，相关性越强

CAD 14个关键外周DE-IRGs的鉴定及免疫诊断模型的构建

我们通过 LASSO 回归降维，最终确定了 14 个基因来构建 CAD 的诊断模型。。通过 ROC 曲线评估已确定的 14 个关键外周 DE-IRG 的诊断性能。ROC曲线下面积分别为CCR9（AUC=0.686）、CER1（AUC=0.604）、CSF2（AUC=0.688）、CXCL2（AUC=0.589）、HTR3C（AUC=0.699）、IL13RA1（AUC=0.650）、IL1A（ AUC = 0.667）、INSL5（AUC = 0.624）、MBL2（AUC = 0.619）、MMP9（AUC = 0.649）、MSR1（AUC = 0.679）、NR4RA2（AUC = 0.657）、NTS（AUC = 0.667）和 TNFRSF19（AUC = 0.686) ，分别。然而，当所有 14 个基因都包含在一个诊断模型中时，训练数据集和测试数据集中的 AUC 分别达到 0.968 和 0.859. 结果证明，这些组合的DE-IRGs具有良好的诊断潜力，也可能成为有希望的CAD预防和治疗靶点。

14基因诊断模型的建立与检验。一个，乙。通过 LASSO 方法将 14 个循环 DE-IRG 鉴定为诊断生物标志物。C、D。ROC曲线评估了14个基因的诊断效果：CCR9（AUC=0.686）、CER1（AUC=0.604）、CSF2（AUC=0.688）、CXCL2（AUC=0.589）、HTR3C（AUC=0.699）、IL13RA1（AUC= 0.650)、IL1A (AUC = 0.667)、INSL5 (AUC = 0.624)、MBL2 (AUC = 0.619)、MMP9 (AUC = 0.649)、MSR1(AUC = 0.679)、NR4RA2(AUC = 0.657)、NTS(AUC = 0.667 ) 和 TNFRSF19 (AUC = 0.686)。E. 包含上述14个基因的诊断模型训练集的ROC曲线分析（AUC = 0.968）。F. 包含上述14个基因的诊断模型测试集的ROC曲线分析（AUC = 0.859）

CAD患者外周免疫特征分析

14 个关键外周 DE-IRG 在 CAD 和对照组之间显示出显着变化。其中CCR9、CER1、CSF2、IL13RA1、INSL5、MBL2、MMP9、MSR1、NTS、TNFRSF19基因表达上调（P < 0.05），CXCL2、HTR3C、IL1A、NR4A2基因表达下调（P < 0.05） P < 0.05）。这些基因显示出显着的正相关，例如 CER1/NTS(r = 0.85)、CER1/IL13RA1(r = 0.79) 和 NTS/TNFRSF19(r = 0.94). 考虑到多种免疫成分在 CAD 诊断和病理机制中的重要作用，我们分析了 CAD 中免疫细胞与 DE-IRGs 表达之间的相互关系。例如，IL13RA1 在中性粒细胞、3 种树突状细胞（活化、未成熟和浆细胞样）、巨噬细胞、记忆 B 细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、MDSC、自然杀伤细胞、肥大细胞、2 种细胞中表现出强烈的上调表达T 细胞（自然杀伤和γδ）和嗜酸性粒细胞（P < 0.01），并在活化的 B 细胞、活化的 CD8 T 细胞和 CD56dim 自然杀伤细胞中快速下调表达（P < 0.01 ）). MMP9 在中性粒细胞、3 种树突状细胞（活化、浆细胞样、未成熟）、单核细胞、记忆 B 细胞、巨噬细胞、γδ T 细胞、嗜酸性粒细胞中表达增加（P < 0.01），在活化 B 细胞中表达呈下降趋势，活化CD8 T、效应记忆 CD4/CD8 T 细胞、未成熟 B 细胞（P < 0.01）。

冠心病患者外周血免疫特征. 一个。已鉴定的 mRNA 的箱线图在外周血中显着不同。乙。气泡图表明，大多数已识别的基因彼此之间呈正相关。C. _ 热图显示了 14 个已识别基因与 28 种免疫细胞之间的相关性。红色：上调；蓝色：下调。颜色的深浅代表相关性的强弱。* P 值 < 0.05，** P 值 < 0.01，*** P 值 < 0.001

在体内验证 10 个候选 DE-IRG 与 CAD 之间的相关性

第20周末，小鼠主动脉弓病理染色（油红O）显示大量脂质斑块聚集，导致管腔狭窄。CAD 模型组的平均体重比对照组急剧增加（P < 0.0001）同时，CAD组外周循环低密度脂蛋白（LDL）和甘油三酯（TRIG）水平显着升高（P < 0.0001）。全血总mRNAs检测显示，CAD模型组CCR9、CSF2、IL13RA1、NTS表达量显着高于对照组。 7E–H, M) ( P < 0.05 )，这与数据集的在线筛选结果表现出相同的趋势。IL1A，在模型组中也有所升高（P < 0.01），与在线数据结果呈相反趋势。然而，两组在 CXCL2、INSL5、MSR1、NR4A2 和 TNFRSF19 方面无差异（P > 0.05）

动物受试者验证。。小鼠主动脉弓油红O染色。。小鼠主动脉弓油红O染色及相应的统计分析( P < 0.01 )。C - E。CAD小鼠的体重、LDL和TRIG均远高于对照组( P < 0.0001 )。F - O。CCR9 mRNA 相对表达值↑ ( P < 0.0001 ), CSF2 ↑ ( P < 0.05 ), CXCL2, IL13RA1 ↑ ( P < 0.0001), IL1A ↑ ( P < 0.01 ), INSL5, MSR1, NR4A2, NTS ↑ ( P < 0.01 ), TNFSF19实时荧光定量PCR检测。*P < 0.05，**P < 0.01，****P < 0.0001。红色“**”表示PCR结果与从数据库中得到的结果相反。“ ↑ ”代表“上调”

IL13RA1激活JAK1/STAT3通路调控CAD中巨噬细胞功能

在体外，ox-LDL上调IL13RA1 mRNA的表达（P < 0.01），激活JAK1/STAT3信号通路（P < 0.05 ，P < 0.01），并增加BMDMs中VEGF-C的产生（P < 0.01）。在体内，类似地，在 20 周 HFD 饮食诱导的 LDL 小鼠（CAD 小鼠模型）的主动脉中， IL13RA1 mRNA 表达、磷酸盐-JAK1、磷酸盐-STAT3、VEGF-C 和 IL-6 蛋白水平增加（P < 0.01 ，P < 0.001）。将 siRNA 转染到 RAW264.7 细胞后，IL13RA1 mRNA 表达显着降低（P < 0.001）。 8个H), 这导致 JAK1 和 STAT3、VEGFC、TGF-β 和 α-SMA 的磷酸化水平下调( P < 0.05 , P < 0.01 )）。IL13RA1 敲低组也降低了 SCARB1 和 ox-LDL 刺激的 CD36 mRNA 水平（P < 0.001，P < 0.01）。。有趣的是，IL13RA1 的敲低增加了 IL-6 的产生（P < 0.0001）。在ox-LDL的刺激下，上述变化趋势一致且更加明显。油红O染色结果显示，IL13RA1敲低组巨噬细胞吸收的脂滴减少

IL13RA1 敲低对 CAD 相关因子表达的影响。一个。PBS 或 ox-LDL 处理的 BMDM 之间的蛋白质表达存在显着差异。乙。A中蛋白条带的相对统计结果( P < 0.05)。C. _ CAD模型与阴性对照组小鼠主动脉蛋白表达的差异。D. _ C. E中蛋白质条带的相关统计结果。PBS 或 ox-LDL 处理的 BMDM 中 IL13RA1 的相对 mRNA 表达。F. _ CAD模型/阴性对照组小鼠主动脉中IL13RA1 mRNA的相对表达。G. 红色荧光表明 Cy3 标记的乱序 siRNA 的转染效率。哈。转染siRNA后RAW264.7中IL13RA1的mRNA表达。我。si-阴性对照 (si-nc)、si-IL13RA1(si-IL13RA1)、si-nc with ox-LDL (si-nc + ox-LDL) 和 si-IL13RA1 with ox-LDL (si -IL13RA1 + ox-LDL) 组。J. _ I. K.中蛋白质条带的相关统计结果。有/没有 IL13RA1 敲低的 ox-LDL 刺激的 RAW264.7 细胞的油红 O 染色。大号。K. M中染色面积的相关统计结果。si-nc、si-IL13RA1、si-nc + ox-LDL 和 si-IL13RA1 + ox-LDL 组中 SCRAB1 的相对 mRNA 表达。否. si-nc、si-IL13RA1、si-nc + ox-LDL 和 si-IL13RA1 + ox-LDL 组中 CD36 的相对 mRNA 表达。Si-nc 对比 si-IL13RA1，*P < 0.05，**P < 0.01，****P < 0.0001。Si-nc + ox-LDL 与 si-IL13RA1 + ox-LDL，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.0001

标签：