鲎变形细胞裂解物 （LAL） 使用者、药典专家和监管机构仍将自己定位于重组因子C （rFC） 检测。药典标准的更改不会在一夜之间发生，目前，愿意更改的用户必须执行替代验证程序 USP <1225>。

在验证替代测定时，需要测定待检测杂质的特异性。该测试必须能够将样品中的杂质与其他无关物质和杂质区分开来。重组版本的鲎生物传感器rFC与LAL测试相比提供了三个级别的特异性。本文旨在强调rFC的三种不同特性，包括 （i） 酶促、（ii） 光谱和 （iii） 遗传水平特异性。

级别 1. 酶特异性

C因子生物传感器与内毒素的分子相互作用是在某些无脊椎动物中发展起来的一种古老的酶促特异性1，其中酶原蛋白与C因子寿司肽区域的内毒素相互作用并结合2。这种结合促进了酶原丝氨酸蛋白酶末端（另一端）的特定键的断裂。通过与内毒素的相互作用，C因子分子现在已被“激活”，并且以这种新形式，对丝氨酸蛋白酶级联中的下一个蛋白质（B 因子）具有特异性。在重组蛋白的情况下，酶原的活化与具有特异性的小荧光团肽进行反应，其特异性模仿C因子与B因子的相互作用（图1）。

这是指内毒素对C因子酶原的酶促激活。

源自参考文献2和3：“在脂多糖介导的C因子活化过程中，其单链形式转化为具有80-kDa 重链和43-kDa轻链的双链中间形式，轻链随后在独特的Phe-Ile键上裂解，形成 7.9-kDa A链和34-kDa B链，并通过二硫键连接在一起。由此产生的三链因子C显示出激活因子B和水解合成三肽底物Boc-Val-Pro-Arg-NH-Np的能力。” 4

一段时间以来，人们已经知道LAL含有一种替代的酶促途径，该途径可以被真菌和纤维素分解副产物激活，称为 β-葡聚糖途径。药物原料和产品中的非内毒素LAL反应物质（LRM） 在最初发现附加途径时引起了相当大的关注。5,6如图2所示，β-葡聚糖作用于凝血酶而不是C因子。因此，LAL对内毒素不具有特异性，而重组C因子检测仅对内毒素具有特异性。LAL用户可以使用β-葡聚糖封闭缓冲液来创建专门针对内毒素的LAL测试，7见图2。

级别 2. 光谱特异性

本研究探索了重组C因子荧光分光光度检测方法的特异性。基于吸光度的测试方法（比色法和比浊法）可发生各种非特异性颜色变化，而重组因子C使用的荧光方法采用非常特定的荧光团，具有非常特定的激发和发射波长。在荧光测定中，使用特定波长（380nm）和用于发射检测的不同特定波长（445nm）的样品的激发在执行测定时提供了另一个水平的特异性。因此，在颜色变化、光进入或其他与化学变化相关的事件方面的随机干扰对于荧光测试是不可见的。

吸光度试验已成功用于LAL显色和比浊法数十年。但对于任何给定的特定样本，可能需要解决为什么无法获得一致的检测结果的问题。Geisler列出了一些可能影响吸光度测定的因素。 

• 选择性：紫外/可见分光光度计不会区分目标样品和吸收相同波长的污染物；

• 杂散光：分光光度计中使用的检测器是宽带的，这意味着它们会对到达它们的所有光做出响应。如果样品中存在反射光的杂质，则可能会记录错误的读数。杂散光还会导致吸光度降低，降低仪器的线性范围；

• 样品条件：吸收结果会受到温度、pH、杂质和污染物的影响。所有这些因素都会改变样品的吸收特性，导致读数不准确。

Geisler 还概述了荧光方法的一般优势。

• 灵敏度：荧光检测的灵敏度比吸收分光光度法高约1000倍；

• 特异性：这种方法只检测荧光分子，与UV/Vis吸收相比具有更高的特异性；

• 浓度范围广：荧光法一般可以检测超过3-6个对数数量级的浓度，而无需稀释或修改样品；

• 准确的结果：荧光测量的灵敏度和特异性可能会带来更精确和准确的读数。