一文了解动物实验AAV靶向眼睛的注射方法
眼睛是感知光线的器官，光投射到对光敏感的视网膜上，视网膜接收并转化成信号通过视神经传递到脑部。
图1 眼睛结构
遗传性视网膜营养不良和视神经病变可导致视觉功能的慢性致残性丧失，而aav是治疗遗传性眼病最有前景的工具之一[1]。根据治疗目的不同，AAV递送到体内的方式不同，有玻璃体腔注射、视网膜下腔注射、前房注射、角膜基质注射等，其中较常用的是玻璃体腔注射（IVT）和视网膜下注射（SR）。
玻璃体腔注射是将AAV直接注入眼球玻璃体腔内，可靶向视网膜神经节或穆勒胶质细胞，但这种注射方法会触发体液免疫反应，阻碍再次注射时AAV表达，需要注射另一只眼睛时建议使用视网膜下腔注射。
视网膜下注射可靶向局部区域（例如黄斑），有利于将AAV递送至视网膜色素上皮（RPE）、光感受器和穆勒胶质细胞。在啮齿类动物中，玻璃体腔注射AAV可有效靶向神经节细胞层，并将AAV扩散至整个视网膜，但由于内界膜的存在，灵长类动物中未见AAV扩散[2]。
接下来小编将详细介绍AAV靶向眼部的注射方式，注射方法后有附上教学视频哦，小伙伴可以将视频网址复制到浏览器中观看学习~
玻璃体腔注射
1、麻醉：4.3% 水合氯醛 0.01 ml/g；
2、散瞳，建议双眼散瞳，以防一眼出现意外时可以迅速换眼；
3、保持眼表湿润；小鼠晶体非常敏感，温度变化、麻醉药物、眼压以及眼表干燥等都会导致小鼠晶体混浊；当然，这种混浊大概 2 小时以后恢复正常；
4、抗生素眼药水、表麻药术前滴眼；
5、调整小鼠头位。小鼠的头是三角形的，因此需要使用棉球或者其他垫一下头部让小鼠眼球保持角膜缘水平位；
6、注射位置：理论上是角膜缘后 1 mm，可以根据情况进行调整；
7、注射切口：推荐小鼠可以用 ALCON 的 10-0 针做切口，非常整齐，33 G 的针进去水密非常好。也可以用破囊针。切口越整齐，跟你的针越匹配，越不易渗漏；
8、进针：针尖垂直进入，随后倾斜。这一步非常重要，小鼠眼球小，晶体球形，倾斜角度小了会损伤晶体，大了会扎上视网膜，出血；
9、注射：缓慢推注。要是迅速推注你取材时会发现视网膜散在出血点，可能干扰试验结果。推针以后留针 0.5-1 min，迅速出针。
视频教程：https://mp.weixin.qq.com/s/LLeTMwQTO_Olue5_owupRA
视网膜下腔注射[3]
1、麻醉：对于成年小鼠，异氟醚吸入麻醉或联合使用氯胺酮（100mg/ml）和赛拉嗪(20mg/ml)按照0.1ml/10g腹腔注射; 对于围产期小鼠，异氟烷吸入麻醉或低温麻醉；
2、使用Vannas直剪沿着闭合的眼睑裂开大约1.5 mm的切口；注意切口不要太大；
3、用弯曲的敷料钳将眼皮分开，以支撑眼睛，并在眼睛下方稍微捏紧眼皮，将其拿起以供注射；
4、在眼球中纬线或中纬线后方做一个小的巩膜切口，切口够注射针尖端通过即可；
5、小心地将注射针插入切口部位，并平行于眼外壁进入视网膜下腔；
6、开始注射，如果正确注射至视网膜下腔，能感受到适度的阻力；缓慢出针，可将针头固定15s，避免注射病毒回流到切口位置；
7、使用弯曲的敷料钳轻轻地将眼睛推回眼眶；将适量0.25%布比卡因，滴在注射部位；
8、小鼠苏醒后置于加热垫上，整个注射过程控制在5min内完成；
9、小鼠恢复活动能力后放回鼠笼。
视频教程：https://www.jove.com/cn/v/55894/ultrahigh-resolution-mouse-optical-coherence-tomography-to-aid
有研究表明AAV2、AAV5、AAV8、AAV9等血清型可有效感染视网膜，AAV8、AAV9和AAV5感染视锥细胞的效率高于AAV2[4-6]。除以上常见血清型外，汉恒生物还可以提供AAV-DJ、AAV-GL、AAV-NN和AAV-shH10靶向视网膜的特异性血清型以及rpe65（视网膜）、ARrr3（视网膜视锥细胞）、hrk（视网膜视锥细胞和视杆细胞）特异性启动子。更多关于AAV在眼部注射方法的问题欢迎咨询汉恒生物！
参考文献
[1] Schön, Christian, Biel, Martin, Michalakis, Stylianos. Retinal gene delivery by adeno-associated virus (AAV) vectors: Strategies and applications. European Journal of Pharmaceutics & Biopharmaceutics, 2015, 95:343-352.
[2] Buck T M , Wijnholds J. Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors (rAAV)-Vector Elements in Ocular Gene Therapy Clinical Trials and Transgene Expression and Bioactivity Assays[J].International Journal of Molecular Sciences, 2020, 21(4197):4197.
[3] Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease[J].Nature Protocols[2023-06-16].
[4] Vandenberghe L H , Peter B , Maguire A M ,et al.AAV9 Targets Cone Photoreceptors in the Nonhuman Primate Retina[J].Plos One, 2013, 8(1):e53463.
[5] Ramachandran P S , Lee V , Wei Z ,et al.Evaluation of dose and safety of AAV7m8 and AAV8BP2 in the non-human primate retina[J].Human Gene Therapy, 2016, 28(2).
[6] Boye S E , Alexander J J , Boye S L ,et al.The human rhodopsin kinase promoter in an AAV5 vector confers rod- and cone-specific expression in the primate retina.[J].Human Gene Therapy, 2012, 23(10):1101-15.
