2023.7.20华中农业大学全英文选修课程生物技术中的微生物学课程第九节课程要点

关于 RTPCR 的问题，RTPCR 是一种用于研究信使 RNA 或克隆真核基因的技术，它需要两个步骤。第一步是制备反向转录的互补 DNA，第二步是进行常规 PCR。这两个步骤需要不同的试剂和酶，并在不同的反应管中进行。是关于 Wolbachia 的讲解，Wolbachia 是一种革兰氏阴性细菌，它是一种寄生在昆虫、节肢动物和甲壳动物中的内生菌。它必须在真核细胞内生长，因此难以培养和研究。目前还没有进行过 Wolbachia 转化或基因编辑等遗传学实验。Wolbachia 存在于许多不同的昆虫中，它们的关系可以从寄生到共生不等。Wolbachia是一种细菌，可以在昆虫细胞内寄生，有些情况下它是共生的，有些情况下它是寄生的；Wolbachia不同的菌株会寄生在不同种类的昆虫中，并以宿主的名称来命名；Wolbachia主要通过母系传播，而且几乎不通过水平传播；垂直传播有多种机制，其中包括行为和母源传播；Wolbachia在宿主中的角色不同，有时会产生维生素帮助宿主，有时则会是寄生的。讲述关于昆虫中的杆状杆菌（Wolbachia）如何通过母系传递影响昆虫的生殖表型，以及它如何利用这些表型调节寄主昆虫的繁殖以增加自身的传播。它通过产卵过程中的营养细胞和卵细胞之间的结构和微管细胞骨架来实现母系传递。Wolbachia 可以诱导昆虫的生殖表型，其中包括杀死雄性、雌性化、半胚形成和孤雌生殖等，以增加寄主种群中雌性数量，从而提高自身的传播效率。其中，孤雌生殖是指昆虫通过无需交配就能克隆自己，从而使其所有后代都被感染，而其他表型则涉及到通过细胞不相容性和救援机制来影响寄主的繁殖。这些机制都是 Wolbachia 利用自身的基因机制来操纵昆虫的繁殖方式，以增加自身的传播效率。其中，CI是一种基因驱动技术，可以将细菌感染推动到昆虫群体中，从而提高其繁殖优势。 CI的应用包括不育昆虫技术和基因驱动技术。不育昆虫技术是将许多雄性昆虫进行绝育，然后释放到野外与雌性昆虫交配，生产死亡后代，从而减少种群数量。基因驱动技术是将一种表型驱动到一个种群中，使用CI时，需要将感染的雄性与未感染的雌性进行交叉，从而实现不育的CI交叉。此外，感染的雌性昆虫也可以用于基因驱动技术，因为它们具有更高的适应性。

wobakia最初是在1924年发现的，并且在20世纪早期，人们开始意识到昆虫可以传播疾病。然而，由于wobakia不会引起疾病，人们在长达50年的时间内失去了对它的兴趣。在20世纪60年代，Hans Laven发现了CI，但当时还不知道这是由wobakia引起的。在20世纪70年代，Janis、Yen和Ralph Bar证明了CI是由wobakia引起的。他们进行了交叉实验，证明了CI是由感染wobakia的昆虫引起的。

实验涉及到杂交，通过感染雄性昆虫的精子，使得与雌性昆虫交配会导致CI（Cytoplasmic incompatibility）。研究中的阳性对照组是CI，阴性对照组是正常杂交。使用抗生素可以去除感染的Wolbachia，这是实验的关键步骤。在1990年代，研究者利用数学模型预测Wolbachia感染会扩散，Michael Terrelli通过PCR实验验证了这个假设。Wolbachia感染可以影响RNA病毒的复制，从而抑制它们的扩散。在试图将Wolbachia应用于控制蚊虫感染疾病的实验中，Wolbachia的致病性使得这个计划失败了。

讲解了用wobakia来抑制RNA病毒在蚊子体内复制的应用，以及Sterile Insect Technique（SIT）的概念和历史。SIT是一种利用无法繁殖的昆虫雄性来压制某一种虫害的技术，其中需要四个步骤：大规模繁殖昆虫、性别分离、灭菌和大规模释放昆虫。这项技术的发明者是美国研究员尼普林（Nipling），他在美国农业部和军队工作时，解决了螺旋体虫害对牛的威胁。现代的SIT应用包括使用放射性、基因突变或wobakia来灭菌，以及大规模释放蚊子来控制疟疾等传染病。在这种情况下，这头牛很健康，但是在初级阶段，伊斯兰国的一只苍蝇可以在牛身上产卵，这会导致伤口，它们会实际上吃动物的活体组织并造成伤口，这样会引来其他苍蝇产卵，情况就会恶化，这可能会导致牛死亡，这些苍蝇可以实际上吃掉很多牛，这是一种恶心的疾病。在南部美国，这是一个很大的问题，所以我们曾经在整个南部美国和中美洲都有螺旋线虫，而它们在南美洲仍然存在。所以，尼姆普林发明了斯特林袜技术来移除螺旋线虫。他们会收集螺旋线虫的幼虫，将它们放在放射性铬管中，以便对它们进行辐射，这会使精子不孕，然后将这些辐射后的幼虫放在飞机上释放，以释放所有不育的雄虫。这是第一个灭螺旋线虫的应用程序，非常成功，现在也有其他应用程序，例如针对蚊子的显性致死基因技术，这种技术可以使蚊子的基因在特定环境中死亡，从而控制蚊子的数量。

其中介绍了两种灭蚊技术：性别分选和不相容昆虫技术（IIT）。首先，讲解了性别分选的过程，使用玻璃板将雌性和雄性蚊子分开，以便能够释放只有雄性蚊子的种群。然后介绍了不相容昆虫技术的实现方式，包括通过引入不同种类的细菌实现昆虫不育。最后，讲解了研究者对不相容昆虫技术的研究，试图找出Wolbachia细菌是如何使蚊子不育的机制。讨论了关于昆虫 Wolbachia 病毒感染如何影响精子成熟的话题。通过介绍精子成熟的过程和 Wolbachia 在精子成熟过程中的表现，得出结论成熟的精子中不含 Wolbachia。讨论者提出了假设，认为 Wolbachia 可能是通过某种蛋白质导致精子不育，并设计了实验来验证这个假设。实验中，他们通过比较正常精子和不育精子中的蛋白质，发现了一个只存在于不育精子中的蛋白质带，从而得出这个蛋白质可能导致精子不育的结论。最后，他们将这个蛋白质带切出来进行进一步分析。

讲述了一些关于蛋白质测序的实验，以及后续的研究探索。实验通过液相色谱串联质谱技术，得到了蚊子与Wobakia菌中的蛋白质列表，发现了Wobakia在精子中的一种名为WPA0282的蛋白质。研究者推测WPA0282可能参与了杀虫不育现象的形成。但问题在于，这个蛋白质的功能仍然不明确，因此需要进行进一步的研究。研究者利用反转录PCR技术验证了WPA0282是一个二基因的操作子，并且猜测这两个基因可能参与杀虫不育现象的诱导和拯救。为了测试这一假设，研究者克隆了这两个基因并将其插入到了蚊子中进行研究。除此之外，研究者还提到了研究未知基因的一般步骤，包括序列比对、克隆、表达等。首先，实验者们在酵母细胞中测试了两个基因（称为Sid A和Sid B），发现Sid B有毒性表型，而Sid A没有。他们还在果蝇中表达这些基因，并证明了A和B组合才能使果蝇存活。接着，他们将这些基因克隆到表达质粒中，并进行了Western blot实验，证明了A和B之间的特定相互作用。这是重要的，因为这表明特定的相互作用是拯救因子的关键。最后，他们还讨论了双向不兼容性和操作子的匹配问题，这是拯救因子是否能够成功的关键。

对于一个实验的结果进行了总结和讨论。实验包括了三个部分：证明两个特定的基因之间具有特异性互作关系、构建表达这两个基因的转基因果蝇、以及分析果蝇交配后的结果。实验结果表明，这两个基因之间的互作关系是特异性的，且一个基因具有毒性，但与另一个基因共同表达时可以被拯救。转基因果蝇的实验结果显示，当两个基因同时表达时会导致不育，因为其中一个基因会降解另一个基因的抗毒性蛋白，导致其毒性蛋白被激活，从而导致不育。作者的研究目标是进一步探索这个分子机制，并找到控制不育的方法。