带你全面了解腺病毒(adenovirus, Ad)包装体系之包装过程

    在前面干货中已经给大家介绍了腺病毒载体及其包装系统，本期小编继续给大家分享AdMax和Adeasy系统的包装流程。

一、整体实验流程

图1 腺病毒两种包装系统流程图

二、实验材料

三、腺病毒包装和纯化

1.       质粒构建和扩增

AdMax系统：构建有目的基因的腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，大量抽提并去除内毒素，用于转染293A细胞。

Adeasy系统：构建连接目的基因的pHBAdEasy质粒并进行酶切线性化；线性化后转化BJ5183感受态（含pAdEasy-1骨架质粒）进行重组，涂板培养单克隆并扩增，抽提质粒进行PacI酶切验证；验证正确的重组质粒转化Stbl3感受态，得到高纯度的重组质粒并进行PacI酶切线性化，用于转染293A细胞。

2.       腺病毒包装

表2 腺病毒包装体系

       这里是以6cm培养皿为例的质粒参考用量。待293A细胞汇合度达到50%-70%时，备好病毒质粒、37℃预热好的DMEM、室温的转染试剂，按操作步骤进行转染。转染6h后更换新鲜培养基。

3.       腺病毒收集

病毒收集前要观察病毒空斑是否形成。为了限制病毒的扩散而让空斑更好地形成，可在培养液中加入低熔点琼脂糖，一般在转染后第10至21天可以在显微镜下看到小的空斑。挑取 3-6 个空斑不等，放入1 ml新鲜培养基中过夜，然后比较滴度，使用滴度最高的一个空斑进行后续实验。

4.       腺病毒扩增

将培养基中的病毒加入新鲜293A细胞培养液中进行病毒少量扩增。至再次出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒（P1代），感染293A细胞，连续进行三代感染，至P4代进行腺病毒的大量扩增并收集病毒。

5.       腺病毒纯化

将病毒从-80℃冰箱取出，室温水浴融化。7000×g 4℃离心10min，弃细胞碎片，收集上清，0.22μm过滤除菌即可用于细胞实验。若用于对腺病毒滴度和纯度要求高的动物实验，则需要采用PEG8000沉淀-CsCl密度梯度离心-透析联用法进行纯化（方法如下）。

①PEG8000沉淀：每100 ml上清加入50 ml PEG8000（20% PEG8000，2.5 M NaCl），冰上放置1h使病毒沉淀（可适当延长时间）。7000×g 4℃离心上述混合物 20 min，弃上清，将沉淀物悬浮在10 ml密度为1.10 g/ml的CsCl溶液中（溶剂为20 mM Tris-HCl，PH8.0），病毒液应呈粉红色。

②CsCl梯度离心：加入2 ml密度为1.40 g/ml的CsCl溶液，然后再缓慢加入3 ml密度为1.30 g/ml的CsCl溶液，再加入5 ml的病毒悬浮液。使用Beckman SW28转子，26,000 rpm，4℃离心2小时。

表3、三种不同密度CsCl溶液的配制 

图2 CsCl梯度离心示意图

③收集病毒：用注射器收集密度在1.30 g/ml和1.40 g/ml之间的病毒条带至透析袋中。（注：透析袋使用前用10 mM EDTA-Na2煮沸10 min，降至室温使用。）

④透析：在透析缓冲液（50 g 蔗糖，10 ml 1M Tris-HCl，PH8.0，2 ml 1M MgCl2，定容至1L）中，4℃搅拌过夜，中间需更换一次透析液。收集病毒，测定病毒滴度。

⑤重悬：500 μl PBS重悬病毒沉淀，一周内使用则置于4℃保存，如需长时间存放需置于-80℃保存。

至此，对于腺病毒包装过程就介绍完了，希望有助大家对腺病毒的了解。汉恒生物专注病毒包装十余年，可提供高质量腺病毒载体工具，欢迎大家咨询~