项目文章丨Nature：大队列单细胞测序解析肝癌的免疫微环境亚型和中性粒异质性
2022年11月9日，Nature 在线发表了北京大学第一医院肿瘤转化研究中心张宁团队与北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）张泽民团队、北京大学人民医院肝胆外科朱继业团队紧密合作的研究成果，综合解析了肝癌的免疫微环境亚型和中性粒异质性。该研究清晰界定了五种肝癌免疫微环境亚型，为肝癌生物标志物探索提供了数据，明确表述了大部分肿瘤相关中性粒亚群的免疫抑制功能，为潜在免疫治疗手段提供了线索。该研究中的单细胞转录组测序服务由博奥晶典提供。
【发表期刊】Nature
【影响因子】69.504
【发表单位】北京大学
研究背景
原发性肝癌（PLC）分为三种组织学亚型：肝细胞癌（HCC）、肝内胆管癌（ICC）和混合型肝细胞癌—胆管癌（CHC）。目前对于 PLC 的肿瘤免疫微环境（TIME）基线了解有限，界限不清晰，阻碍了肝癌患者生物标志物的发现。肝癌研究亟需对临床信息充分的多种 PLC 亚型患者进行单细胞研究来解析肿瘤中的全部细胞类型。另外，关于肿瘤中的中性粒细胞是促癌还是抑癌作用仍存在争议，没有研究对于肿瘤中的中性粒异质性进行全面解析。
研究思路
主要结论
1、大规模肝癌患者单细胞图谱
研究对来自 124 例未治疗的肝癌患者的 160 个样本进行了单细胞转录组测序，包括 79 名 HC 例患者，25 例 ICC 患者和 7 例 CHC 患者（图1a），共得到 1,092,172 个细胞数据，分为 89 个细胞群（图1b, c）。得益于大型队列和非富集策略，数据得到了多种细胞类型和大量中性粒信息。数据中肿瘤免疫微环境（TIME）细胞具有显著的组织和肿瘤亚型特异性。拷贝数分析显示大部分上皮细胞是肿瘤细胞，并且具有患者异质性。该图谱数据还整合了队列临床信息和基因组信息，有利于肝癌细胞异质性的综合分析和细节研究。
2、揭示肝癌五种免疫微环境亚型（TIMELASER）
研究人员根据细胞群共富集模式将 TIME 细胞类型聚类成 5 个细胞群模块（CM1-CM5）（图2a）。根据这些模块在队列中的富集差异，结合细胞群、功能标记基因表达、TIME 相关基因特征和预后相关性，将患者分成 5 种 TIME 亚型（图2b, c）。
其中，CM1 包括活性髓系和 T 细胞群，富集 CM1 的患者具有免疫激活状态，因此定义为免疫激活型 TIME（TIME-IA）；CM2 富集 Mph_03_SPP1 群并高表达 IL1B，具有髓系免疫抑制特性和促癌趋化因子，且与临床预后差正相关，CM2 富集的患者被定义为髓系免疫抑制型 TIME（TIME-ISM）；CM3 和 CM4 均含有基质细胞，其中 CM3 高表达肿瘤激活基因，富集胞外基质和肿瘤相关成纤维细胞（CAF）特征，与预后差正相关，CM3 患者可以定义为基质免疫抑制型（TIME-ISS）；CM4 含有内皮和间充质细胞群，缺少免疫细胞，具有排斥 T 细胞的 CXCL12+ 成纤维细胞，GZMK+ CD8+ T 细胞也在该模块富集但多色免疫组化（mIHC）显示毒性 T 细胞被隔离在肿瘤区域外（图2f），因此 CM4 富集的患者被定义为免疫排斥型 TIME（TIME-IE）；CM5 含有肝驻留细胞群，包括驻留 NK 细胞群、枯否细胞和肝窦内皮细胞，与预后较好正相关，所以 CM5 富集患者被定义为免疫驻留型 TIME（TIME-IR）。
作者将该分类命名为 TIMELASER（图2d），生存分析显示该分型与临床预后结果一致（图2e），说明了这种分型方法的可靠性和临床相关性。作者还用已发表的单细胞和批量 RNA 测序结果进行了验证。
另外，作者还发现 TIMELASER 亚型间具有不同的趋化因子和细胞因子表达模式（图2g, h）。例如 CXCL9/10/11-CXCR3 在 TIME-IA 中富集，CXCL1/3/8-CXCR2 在 TIME-ISM 中富集。外显子组数据显示 TIMELASER 亚型间还具有肿瘤细胞的驱动基因突变差异。这些分析说明 TIMELASER 分型不仅表征了患者间的 TIME 差异，还体现了深层次的趋化因子网络和肿瘤体细胞变异差异。
3、肝癌中的中性粒异质性及功能
研究得到了共 34,307 个中性粒细胞，分为 11 个亚群，具有明显的组织和肿瘤类型特异性（图3a）。Neu_02_S100A12、Neu_03_ISG15 和 Neu_04_TXNIP 是外周血中性粒（PBNs），Neu_05_ELL2 和 Neu_06_PTGS2 是癌旁中性粒（ALNs），另外 6 类富集于肿瘤组织，定义为肿瘤相关中性粒（TANs）（图3b）。拟时序分析揭示了从 PBNs 到 ALNs 再到 TANs 的分化轨迹（图3a）。调节子分析显示不同来源的中性粒表达不同的转录因子（图3c），ATAC 结果验证了这些转录因子的特异性活化。这些结果说明了肝癌中中性粒的分化是由不同的转录因子进行时空特异性调节的。
作者接下来着重研究 Neu_11_CCL4 和 Neu_09_IFIT1 两种中性粒亚群。CCL4+ TANs 高表达 CCL3 和 CCL4（图3d），病人来源 TANs 相对于非 TANs 具有更高的 CCL4基因活化和 CCL4 蛋白水平（图3f,g）。趋化实验显示 TANs 共培养可以招募单核细胞（图3h）。通过体外 PBNs 与肝癌细胞系的共培养，他们诱导出了类似于 Neu_11_CCL4 亚群的“体外TANs”（图3e）。这些结论说明了 TANs 的趋化因子分泌功能和 CCL4+ TANs 对巨噬细胞的招募作用。
TANs 中还高表达 CD274（编码PD-L1）（图3i），“体外 TANs”也表达 CD274 并且表达量随时间升高（图3j），流式分选确定“体外 TANs”高表达 PD-L1 蛋白（图3k）。ATAC 和流式分选均表明病人来源 TANs 也具有 CD274 活化和 PD-L1 表达的特性（图3l, m）。体外 TANs 和病人来源 TANs 与 CD8+ T 细胞的共培养都显示 TANs 可以通过高表达 PD-L1 抑制 T 细胞活性（图3n-p）。另外 mIHC 展示了 PD-L1+ 中性粒和 PD1+ CD8+ T 细胞的临近位置关系（图3q）。这些实验表明肝癌中的 PD-L1+ TANs 可以抑制毒性 CD8+ T 细胞活性。
4、小鼠肝癌模型揭示中性粒的亚群保守性及功能
为了进一步研究 TANs 的体内的功能异质性，研究人员构建了两种基于 Alb-cre/Trp53fl/fl 肝脏特异敲除小鼠和肝癌驱动突变的小鼠肝癌模型（Myc-∆90Ctnnb1，pTMC；Myc-KrasG12D，pTMK）。作者取 6 只小鼠的外周血、癌旁和肿瘤共 21 份样本进行单细胞转录组测序，得到 17,780 个中性粒细胞，分为 12 个细胞群，这些细胞群具有组织特异性和明显的发育轨迹（图4a, b）。中性粒亚群间一致的特征基因表达模式说明了其保守性（图4c）。人肝癌患者的 TIME-ISM TANs (Neu_09/10/11) 分别对应小鼠中性粒亚群 mNeu_10/11/12，而且小鼠 TANs 也高表达 Cd274（图4d），这些结果证明了中性粒亚群的保守性，为后续在小鼠肝癌模型进行中性粒靶向治疗建立了基础。
研究人员通过 anti-Ly6G 抗体去除模型小鼠体内的中性粒，中性粒去除后小鼠肿瘤明显缩小（图4e, f），TANs 数量和 PD-L1 表达均降低（图4g），免疫组化验证了中性粒和增殖恶性细胞的减少（图4h）。结果还显示约 70%的中性粒被去除，浸润性巨噬细胞减少 46.6%，CD8+ T 恢复活性（免疫检查点标记 PD-1 和 TIM3 降低）（图4g）。荧光报告基因实验验证了肿瘤的缩减（图4i, j）。对两只 anti-Ly6G 治疗小鼠的骨髓、外周血、癌旁组织和肿瘤的单细胞测序显示，大部分 TANs 被去除，但 mNeu_09_Apoa2 亚群增多，该群对应人肝癌的 Neu_07_APOA2 亚群与良性预后正相关，这类 TANs 高表达脂质代谢特征，可能属于脂质相关中性粒。总之，小鼠模型中的中性粒去除能够改变 TANs 组分，有效削弱肿瘤进展。
总结
文章通过分析来源于肝癌和小鼠模型的 130 万个单细胞转录组数据，构建了一套全新的肝癌的免疫微环境分型体系：TIMELASER，对于该分型体系的深入分析有助于我们对肿瘤-微环境和微环境-微环境互相作用的理解，辅助发现新的生物标志物和免疫治疗靶标。另一方面，文章揭示了肝癌中性粒的异质性，明确表明大部分肿瘤相关中性粒的促癌作用，并在小鼠模型中验证了去除中性粒可以有效抑制肿瘤进展，为新的肝癌免疫治疗靶标提供了线索。
参考文献：
Xue R, Zhang Q, Cao Q, Kong R, Xiang X, Liu H, Feng M, Wang F, Cheng J, Li Z, Zhan Q, Deng M, Zhu J, Zhang Z, Zhang N. Liver tumour immune microenvironment subtypes and neutrophil heterogeneity. Nature. 2022 Nov 9. doi: 10.1038/s41586-022-05400-x. Epub ahead of print. PMID: 36352227.
