BCECF-AM,PH敏感探针

BCECF-AM,PH敏感探针（117464-70-7）是一种对细胞内pH敏感的新型荧光探针，分别用490nm和440nm波长激发BCECF所得到的发射荧光之比与pH有很好的线性关系。BCECF-AM是乙酰甲酯化的BCECF，BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，BCECF-AM没有荧光，进入细胞后被细胞内的酯酶水解成BCECF，从而被留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发形成绿色荧光。

检测原理

核仁是形成核的结构之一，并成为核糖体生物发生的起点。 核仁中有许多核糖体RNA（rRNA），进行rRNA的转录和加工。 虽然核仁的形态变化被认为是癌症诊断的指标之一，但也有一些科学报道描述了核仁与 DNA 损伤、自噬、病毒感染和细胞衰老之间的关系。 Nucleolus Bright 染料是小分子，它们与核仁中的 RNA 结合以发射荧光。 用 Nucleolus Bright 染料染色后，无需任何洗涤步骤即可观察到核仁。
Nucleolus Bright 对存在于核仁之外的 RNA 起反应，但它在核仁中显示出强烈的荧光，这是 rRNA 产生的位点。 我们建议与 DAPI 共同染色，以便清晰地成像核仁。

BCECF, AM(117464-70-7) 介绍：
BCECF被广泛地用于细胞内pH的测定。加入2个额外的羧化物基团改进了这种羧基荧光素。加入的两个羧基使得它能更好地被固定在细胞内。BCECF具有很好的水溶性，是因为它在中性pH时带有4-5个负电荷。但是BCECF却很难穿过细胞膜进入到细胞内。它的pKa值为6.97，高于其它的羧基荧光素。BCECF在激发光谱439nm处有等吸收点，因此它能和Fura 2一样可用比率法测定。505nm和439nm通常是非常有用的用于比率测量的波长，一般会将490nm和450nm的滤光片加在激发光源的前面。而530nm的滤光片则是用来查看它的荧光信号的。这里要注意的是激发光谱与吸收光谱有一些细微的区别。BCECF-AM是乙酰甲酯化的BCECF。它能够轻易地进入到细胞内。就和其他的乙酰甲酯类一样，BCECF-AM只需要通过孵育就能进入细胞。BCECF-AM对潮湿非常敏感，所以要小心保存。如果DMSO储存液的颜色从浅黄色变为深橙色就代表了AM的分解。所以通过对颜色变化的观测，能判断AM酯的水解情况。

BCECF/AM, a membrane-permeable fluorescent indicator for the measurement of cytoplasmic pH with an Abs/Em = 503/520 nm. BCECF/AM readily and rapidly diffuses through cell membranes. BCECF/AM is an acetoxymethyl ester of BCECF, is a variable mixture of cell-permeable ester derivatives of BCECF that are hydrolyzed by cytosolic esterases to yield intracellularly trapped indicator BCECF. BCECF/AM is a selective vacuolar accumulation of the fluorescent pH-indicator used to monitor intracellular pH changes in mammalian fibroblasts, gastric cells, lymphocytes, myocytes, and distal convoluted tubules.

BCECF-AM不仅被广泛用于哺乳动物细胞的研究，也有报道用于动物组织、植物细胞、细菌和酵母等的细胞内pH水平检测。在有细胞内pH变化的细胞毒性、细胞凋亡、细胞粘附、药物抵抗、细胞趋化等过程中BCECF AM被广泛应用。BCECF-AM(pH荧光探针)需用无水DMSO(anhydrous DMSO)配制。

 Maximum Excitation WavelengthMaximum Emission WavelengthFluorescence of MeOH fixed cellsFluorescence of PFA fixed cellsNucleolus Bright Green513 nm538 nm〇〇Nucleolus Bright Red537 nm605 nm〇〇

核仁检测
用 4% PFA 或 MeOH 固定 HeLa 细胞后，用 PBS 洗涤细胞，然后用 1% Triton X-100 透膜。 加入核仁亮绿或核仁亮红 (N512) 和核染色染料 DAPI，并使用共聚焦显微镜成像。观察到 DAPI 染色的细胞核（蓝色）中的几个核仁。

<染色条件>
- 用 PFA 固定
将细胞浸入 4% PFA 中 5 分钟，Triton X-100 中 20 分钟。 然后在每个荧光探针中孵育 60 分钟。
- 用甲醇固定
将细胞浸入冷 MeOH 中 1 分钟，Triton X-100 中 20 分钟。 然后在每个荧光探针中孵育 5 分钟。

<检测条件>
核仁亮绿色 Ex. 488nm / Em. 500-600nm
核仁鲜红 Ex. 561nm / Em. 565-650nm
DAPI Ex. 405nm / Em. 450-495nm

核仁定位
第 3 代 WI-38 细胞用 4% PFA 固定，用抗原纤维蛋白一抗和二抗进行免疫染色。 加入核仁亮绿或核仁亮红 (N512) 和核染色染料 DAPI，并使用落射荧光显微镜 (Keyence, BZ-X710) 进行成像。

<检测条件>
核仁亮绿色：Ex. 450-490 nm / Em. 500-550 nm
核仁亮红色：Ex. 533-548 nm / Em. 570-640 nm
DAPI：Ex. 340-380nm / Em. 435-485nm
抗原纤维蛋白抗体：Ex. 590-650 nm / Em. 668-733 nm

检测衰老细胞
不同代的 WI-38 细胞用 4% PFA 固定并用 PBS 洗涤。 然后用 1% Triton X-100 渗透膜。 加入核仁亮绿或核仁亮红 (N512) 和核染色染料 DAPI，并使用共聚焦显微镜成像。

<染色条件>
将细胞浸入 4% PFA 中 5 分钟，Triton X-100 中 20 分钟。 然后在每个荧光探针中孵育 5 分钟。

<检测条件>
核仁亮绿色：Ex. 488 nm / Em. 500-600 nm
核仁亮红色：Ex. 561 nm / Em. 565-650 nm
DAPI：Ex. 405nm / Em. 450-495nm

用共焦定量图像细胞仪进行定量
不同传代数的WI-38细胞固定后用Nucleolus Bright Green和DAPI染色。 然后使用共焦定量图像细胞仪 CQ1 分析每个染色的细胞。通过成像数据分析核仁在 405 nm 和 488 nm 处测量细胞核和核仁成像数据作为发射波长，并通过 CellPathfinder 分析细胞核中的核仁数量。

核仁数目分析
如第 19 代细胞中所见，含有一个核仁的细胞比例增加，而含有一个以上核仁的细胞减少。该结果与已发表报告的数据一致。 一份报告表明，衰老的 WI-38 细胞中的核仁数量减少了。 另一份报告表明，SETD8 敲低衰老细胞中的核仁数量和总面积发生了变化。

*1 P. M. Bemiller, L. Lee, “Nucleolar changes in senescing WI-38 cells”, Mech. Ageing Dev., 1978, 8 , 417.
*2 H. Tanaka, S. Takebayashi, A. Sakamoto, T. Igata, Y. Nakatsu, N. Saitoh, S. Hino, M. Nakao, “The SETD8/PR-Set7 Methyltransferase Functions as a Barrier to Prevent Senescence-Associated Metabolic Remodeling.”, Cell Rep., 2017, 18(9), 2148.

Excitation & Emission