GST pull down 实验方法及检测报告模板

一、实验目的：构建GST-P53融合表达载体,并过表达此蛋白。通过GST-pull down 沉淀细胞中与P53蛋白互作的其他蛋白，并通过WB鉴定P53与HSP70是否互作。

 

二、实验材料

l 主要试剂

l 主要仪器及器材

三、 实验方法 

1、 捕获蛋白制备

1） 收集的细胞中加入1mL 预冷的PBS; 吹打混匀后，1500g 离心 5 min，去除上清，再重复洗涤细胞 1 次;

2） 加入800ul cell lysis buffer(预先加入Protease inhibitor及PMSF)

3） 17000g，4℃离心10min；转移上清到一个新的1.5mL离心管中；

4） 取30ul上清样本作为input,-80℃保存备用。

5） 剩余样本用于后续pull down 实验。

注：如果需要验证两个蛋白是否直接互作，则需要过表达并纯化捕获蛋白。

2、 诱饵蛋白制备

1） 取诱导成功的 GST-诱饵蛋白表达大肠杆菌菌液（GST-P53） 5 mL，4000 g离心 10 min，去除上清培养基；

2） 加入5 mL PBS吹打混匀后，1500g 离心 5 min，去除上清；

3） 加入1 mL PBS并加入10 ul Protease inhibitor 和 10 ul PMSF，吹打混匀；

4） 在超声波破碎仪上冰浴超声样品至溶液透亮；

5） 4℃，17000g 离心超声破碎样品 10min，转移上清到1.5 mL离心管中

3、 磁珠准备

1） 将GSH 磁珠颠倒混匀后，分别取 50 ul GSH 磁珠到1.5ml离心管中，将离心管置于磁力架上静置3min;待澄清后弃上清；

2） 加人 500μL Wash buffer，颠倒混匀，置于磁力架上静置3min，待澄清后弃上清，重复洗涤1 次；

3） 加50 ul Wash buffer重悬磁珠

4、 诱饵蛋白与磁珠结合

1） 分别取500ul新鲜制备的诱饵融合蛋白GST-P53及GST蛋白，加入到准备好的 50 ul GSH 磁珠悬液中；

2） 4℃，垂直混匀器上摇动孵育 30min；

3） 置于磁力架上静置3min，待澄清后弃上清；

4） 加入预冷的500μL Wash buffer， 4℃垂直混匀器上摇动 5min洗涤，置于磁力架上静置3min，待澄清后弃上清；

5） 重复上上步骤2次，即共洗涤3次；

5、 GST-pulldown

1） 分别向步骤 4获得的GST-P53及GST管中加入300μL捕获蛋白裂解液；

2） 4℃，垂直混匀器上翻转孵育过夜；

3） 置于磁力架上静置3min，待澄清后弃上清；

4） 磁珠加入预冷的500μL Wash buffer，随后 4℃颠倒混匀5min，置于磁力架上静置3min，待澄清后弃上清；

5） 重复上步骤4次，即共洗涤5次。

6） 分别加入 50μL Elution buffer，沸水浴变性洗脱 10min；

7） 磁力架静置吸附磁珠，收集上清-80℃保存；

 

6、 实验结果

1）固定：电泳结束后，取凝胶放入约100ml固定液（配方见表2）中，在摇床上室温摇动20分钟，摇动速度为60-70rpm。

表2 固定液配置

2） 30%乙醇洗涤：弃固定液，加入100ml 30%乙醇，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。

3）水洗涤：弃30%乙醇，加入200ml双蒸水，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。

4）增敏：弃水，加入100ml银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2分钟，摇动速度为60-70rpm。

5）水洗涤(共2次)：弃原有溶液，加入200ml双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。

6）重复步骤5

7）银染：弃水，加入100ml银溶液(1X)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。

8）水洗涤：弃原有溶液，加入100ml双蒸水，在摇床上室温摇动1-1.5分钟，摇动速度为60-70rpm。

9）显色：弃水，加入100ml银染显色液，在摇床上室温摇动3-10分钟，直至出现比较理想的预期蛋白条带，摇动速度为60-70rpm。

10）终止：弃银染显色液，加入100ml银染终止液(1X)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。

11）水洗涤：弃银染终止液，加入100ml双蒸水，在摇床上室温摇动2-5分钟，摇动速度为60-70rpm。在双蒸水中保存或制成干胶。

1、 实验结果

a.银染结果：

b.WB检测结果：

7、项目内容

广州如期生物技术有限公司成立于2016年，始终以探索科学、服务客户为己任；致力于为高校、科研院所、医院、制药企业提供全面、便捷、专业的技术服务和产品。技术方面我们专注于生物医学领域：公司拥有完善的技术服务平台，覆盖分子生物学，转录组学、代谢组学、蛋白组学，表观遗传等多个科研平台。在产品方面，自主研究多种类型科研试剂盒20多项，如：COIP、CHIP、RIP等科研检测试剂盒，较之同类型的进口试剂盒，极大的降低了科研成本。

公众号：如期生物

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