1 前言说明

酶切鉴定：提纯重组质粒，用相应的限制性内切酶（一种或两种）切割质粒释放出的插入片断，对于可能存在双向插入的重组子还可用适当的限制性内切酶消化鉴定插入方向，然后用凝胶电泳检测插入片断和载体的大小。

酶切连接：

2 酶切鉴定

2.1实验操作程序

2.1.1酶切操作：

以酶切and连接方式构建质粒：目的质粒，使用Bam H1和Xba I两种酶进行反应，目的：获得局部片段

酶切反应体系（冰水浴条件）：

配置OK体系，放置37℃恒温箱，2h,然后4℃过夜

2.1.2琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA：

材料：1 x TAE；琼脂糖；EB，Mark（5-10ul），Buffer（50ul+10ulBuffer）

1.按照相应配置体系，称量并倒入取锥形瓶，加入1 x TAE溶解；

2.放在微波炉加热至沸腾，两次（第一次约45s，第二次约15s）

3.待稍凉后（切记不能凝固），加入EB，倒入卡槽里面（注意梳子插孔方向）

4.待凝固后，约15min，放入电泳槽（注意拔梳子要小心）。

5.电压：11V，电流198mA，时间：45min

6.紫外光照射，切胶，用1.5ml离心管回收

7.加样时注意胶孔方向，切勿搞反了

2.1.3目的基因（DNA）胶回收

1.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下来（尽量切除多余部分）放入干净的1.5ml离心管中，称重。

2.向胶块中加入等倍体积溶液的PN（如果凝胶重0.1g，其体积可视为100ul，则加入100ul PN溶液），放置在50℃金属浴溶解，期间间隔3-5min上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

3.此时，向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管）加入500ul平衡液BL，12000rpm（~13400*g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

4.将溶解OK的胶溶液加入到吸附柱CA2（吸附柱放入收集管）中，室温静置2min,12000rpm（~13400*g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中

5.向吸附柱CA2中加入600ul漂洗液PW（使用前检查是否已经加入无水乙醇），12000rpm（~13400*g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中

6.重复上一步骤

7.将吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm（~13400*g）离心2min，尽量除尽漂洗液，将吸附柱CA2置于室温防止数分钟，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验

8.将吸附柱CA2放入新的离心管中，向吸附膜中间悬空加入30ul的ddH2O，室温静置2min，12000rpm（~13400*g）离心2min，收集DNA溶液

9.纯度检测

2.1.4酶连接实验

酶连接反应体系（冰水浴）：

配置OK体系，放置金属水浴锅（16℃）连接，过夜。

后续【质粒转化】【挑克隆】【摇菌】【中提】