「2023第四届中国（北京）生物药工艺高峰论坛」热蛋白质组学分析(TPP)在药物靶点发现
热蛋白质组学(TPP)是基于蛋白质在受热时变性溶解度降低的原理。蛋白质可以在与小分子(如药物或代谢物)、核酸或其他蛋白质相互作用时或在翻译后修饰时改变其热稳定性。TPP使用基于多重定量质谱的蛋白质组学来监测数千种表达蛋白质的熔解曲线。重要的是，这种方法可以在体外或在体内进行。它已被成功地应用于识别药物的靶标和非靶标，或研究蛋白质-代谢物和蛋白质-蛋白质相互作用。因此，TPP为蛋白质在原生环境和蛋白质组范围内的蛋白质状态和相互作用提供了独特的见解，使我们能够研究基本的生物学过程及其潜在的机制。接下来介绍一篇TPP的应用案例。
寄生虫(线虫)会导致破坏性疾病，给世界各地的人类和其他动物带来巨大的痛苦。这些寄生虫的控制在很大程度上依赖驱虫疗法，但治疗失败和对这些药物的耐药性普遍存在。由于开发针对寄生线虫的疫苗在很大程度上没有成功，人们越来越重视发现新的驱虫方法来对抗抗药性蠕虫。2022年10月14日，Frontiers in Pharmacology杂志(IF:5.988)上在线发表了题为“Thermal proteome profiling reveals Haemonchus orphan protein HCO_011565 as a target of the nematocidal small molecule UMW-868”的研究论文。该研究采用热蛋白质组学(TPP)来探索HIT药理学。利用先进的结构预测和对接工具，推断出驱虫小分子（HIT化合物：UMW-868）在高致病性捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）和其他具有重要社会经济意义的寄生线虫中的全新寄生虫特异性靶标(HCO_011565)。
实验设计
经UMW-868处理的H. Contortus xL3s和对照组H. Contortus xL3s；分别在10个温度梯度处理下的TPP热蛋白组研究。
研究思路
研究结果
UMW-868在H. contortus中引起主要细胞死亡，而对哺乳动物肝细胞没有细胞毒性或有丝分裂毒性
作者测量了经UMW-868处理的捻转血矛线虫xL3s的细胞死亡。暴露90小时后，在UMW-868-处理的xL3s（>5µM）中检测到细胞死亡，而用非活性类似物（A-3155）处理的xL3s仍然存活（图1A）。在50μM时，UMW-868可100%杀死处理过的xL3s，其IC50值为34.8uM(图1B)。暴露于UMW-868 168h后，幼虫全身可见死亡细胞(图1C)，而暴露于A-3155或DMSO的xL3s则未检测到死亡细胞(图1C)。接下来测试了UMW-868对HepG2细胞和线粒体的毒性；UMW-868在高达100µM的浓度下没有表现出任何明显的细胞毒性或有丝分裂毒性(图1D)。
孤儿蛋白HCO_011565是UMW-868靶标的证据
前期实验证明了UMW-868具有驱虫活性，并且对哺乳动物肝细胞没有细胞或线粒体毒性，接下来的目标是确定该化合物的作用靶点。利用热蛋白质组学(TPP)，共鉴定和定量了3,678个蛋白。通过非参数响应曲线分析(NPARC)评估定量蛋白质的热熔曲线，将非参数模型与温度曲线数据拟合后，得到了2,591条不同的熔解曲线图谱。经过筛选共鉴定了55种蛋白质，它们的热稳定性和丰度在UMW-868存在的情况下发生了变化。在这55种蛋白质中，两种未表征的蛋白质(分别由基因HCO_011565和HCO_014287编码),在UMW-868存在下表现出最高的热稳定性(图2)，这表明它们是UMW-868的作用靶标。
随后，作者研究了这两个分子的转录表达水平。研究发现HCO_011565在H. contortus的所有关键发育阶段都有转录表达，在卵、L3、L4(四龄幼虫)和成虫阶段都有高表达。对于HCO_014287，仅在L2和L3阶段记录到中到高的转录水平，但在其他发育阶段表达有限或没有表达(图3B)。基于这些发现，选择了HCO_011565作为进一步的研究对象。
药物化学导致H. contortus的效力增强
接下来作者探究了改变其（UMW-868）化学结构以尝试增强效力。在UMW-868的“南部区域”，用噻吩取代芳基环不会改变xL3s运动效力（A-3126；IC50 12.1 µM）。然而，效力随着向芳基中添加4-甲基（A3136；IC50 4.8 µM）而增加，并随着4-三氟甲基取代（A-6501；IC50 1.6 µM）而进一步增强。在“北部区域”（R2），用乙氧基取代正丙基提高了效力（A-3134；IC50 7.8 µM），并通过引入4-二氟甲氧基进一步增强了效力（A- 4340；IC50 4.0 µM）。根据xL3s活力降低的结果，其中一些修饰类似物（即 A-3136、A-6318、A-6501和 A-4340）增强了对幼虫发育的抑制效力。
总结
该研究基于高通量表型筛选，确定了一种候选驱虫药物 (UMW-868)，它对H. contortus和至少三种其他线虫物种具有可重复且非常有效的杀虫活性。使用热蛋白质组学分析(TPP)，在H. contortus中发现了一个新的蛋白质靶标（命名为 HCO_011565），它与UMW-868具有相互作用。该研究建立的工作流程：将体外筛选、效力评估和TPP指导的蛋白质靶标识别与计算机结构预测和配体对接相结合，可能是一种有用的工具，可支持发现新型驱虫药和匹配目标候选物以进行优先排序和后续评估。鉴于世界范围内具有重要农业和兽医意义的线虫普遍存在驱虫药耐药性问题，这具有重大意义。
会议信息
BPCF2023第四届中国（北京）生物药工艺高峰论坛四月与您相约北京！
主办单位：生物药资讯
会议主题：BPCF2023第四届中国（北京）生物药工艺高峰论坛
会议时间：2023年04月03-04号
会议地点：北京朗丽兹西山花园酒店
