由ECT2和USP7形成的正反馈回路有助于乳腺癌发生

写在前面

        今天推荐的是由天津医科大学医学部在2020年8月29日发表于Theranostics（IF：11.556，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Lei Shi教授，研究表明由ECT2和USP7形成的前馈调节回路有助于乳腺癌发生。

研究背景

        包括上皮细胞转化因子ECT2在内的一些鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）被认为是通过激活不同的致癌GTP酶来驱动致癌的。然而，ECT2不依赖GEF的功能是否也在肿瘤发生中起作用仍不清楚。

摘要部分

        ECT2在乳腺癌中起着促进肿瘤的作用，GEF活性缺陷的ECT2能够缓解ECT2耗竭带来的乳腺癌细胞生长缺陷。作者证明了ECT2与泛素特异性蛋白酶USP7的物理相互作用，并以独立于GEF活性的方式在功能上促进USP7的分子间自结合、去泛素化和稳定化。反过来，USP7去泛素化并稳定ECT2，形成一个前馈调节回路，最终维持致癌蛋白MDM2的表达。作者的研究发现了ECT2在促进乳腺癌细胞生存中的GEF独立作用，为ECT2和USP7的相互调节提供了分子见解，并支持将ECT2/USP7作为乳腺癌干预的潜在目标。

研究内容

1.ECT2 在乳腺癌发生中的GEF独立作用       

        作者首先通过Oncomine进行疾病分析发现，ECT2在不同组织学的乳腺癌样本中高度表达，表明ECT2与乳腺癌有关。为了证实ECT2参与乳腺癌的发生，作者通过免疫组织化学（IHC）染色发现ECT2在乳腺癌中高度表达，且ECT2的表达水平与肿瘤等级基本相关。     

        作者接下来分析了ECT2的表达及其与乳腺癌患者临床行为的相关性。来自GEO数据集的Kaplan-Meier生存分析表明，ECT2表达的升高预示着乳腺癌患者的总生存率（OS）、无复发生存率（RFS）、无远处转移生存率（DMFS）和进展后生存率（PPS）都很差。这些发现共同表明ECT2在乳腺癌中具有促进肿瘤的作用。     

        为了研究ECT2在乳腺癌发生中的作用，作者首先分析了ECT2敲低对乳腺癌细胞生存的影响。群落形成实验显示，敲除ECT2严重阻碍了乳腺癌细胞的群落大小和数量。为了研究ECT2的GEF活性是否对肿瘤的生存至关重要，作者通过shRNA敲低处理及群落形成实验表明，ECT2/GEFmt（GEF活性缺陷的ECT2突变体）可以抵消ECT2敲低所引起的生长缺陷。 

研究结论：ECT2促进肿瘤细胞的存活，且不依赖于GEF。

2.ECT2与泛素特异性蛋白酶USP7有相互作用     

        FLAG-ECT2 的蛋白质复合物的质谱分析表明，ECT2 与多种蛋白质相关，包括 USP7。为了证实ECT2与USP7的体内关联，使用来自 MCF-7 细胞的细胞提取物进行了免疫共沉淀实验，证明ECT2与USP7免疫共沉淀。另一方面，作者还发现USP7可以与 ECT2/GEFmt免疫共沉淀，并且该突变体对USP7表现出与野生型ECT2(ECT2/wt) 相似的结合亲和力。

        接下来，作者使用免疫荧光染色和共聚焦显微镜分析显示ECT2与USP7共定位。此外，作者使用 LacO-LacI 靶向系统测试了USP7是否与ECT2共定位，作者观察到内源性USP7形成与 ECT2-mCherry-LacI 共定位的明显病灶，而USP7在表达 mCherry-LacI 的细胞中没有形成病灶。此外，对来自不同细胞区室的蛋白质分级进行的免疫共沉淀分析表明，USP7可以与细胞核ECT2共免疫沉淀，但不能与细胞溶质 ECT2共沉淀。

研究结论：核ECT2与USP7发生直接相互作用，并且ECT2在该蛋白质复合物中的分子行为可能与典型的GEF-GTPase信号无关。

3.ECT2抑制USP7多泛素化并促进其稳定     

        作者接下来探究ECT2是否可以变构增强USP7的去泛素化酶活性。为了检验这一假设，在ECT2存在与否的情况下，使用 K48 或 K63 连接的泛素连接和表达USP7的细胞进行了体外去泛素化分析。结果表明，重组USP7能够切割泛素链，而添加ECT2对USP7催化的泛素链切割的影响很小。尽管ECT2未能激活USP7的酶活性，但作者发现ECT2敲低导致几种USP7底物在蛋白质水平上显着下调，但在 mRNA 水平上没有。另一方面，作者发现ECT2缺陷的几种细胞中USP7的蛋白质水平显着降低，而USP7mRNA 水平基本不变。     

        接下来，用 FLAG-ECT2 和靶向ECT2的 siRNA 转染 MCF-7 细胞。蛋白质印迹分析显示ECT2表达的增加能够恢复USP7在ECT2缺陷细胞中的表达。接下来，作者发现蛋白酶体特异性抑制剂 MG132 的添加有效地阻止了与ECT2敲低相关的USP7的减少，表明这种作用可能是通过蛋白酶体介导的蛋白质降解机制。

        为了测试ECT2促进的USP7稳定是否是通过对抗泛素化介导的蛋白酶体降解，作者检查了ECT2是否具有拮抗USP7泛素化的功能。对构建的不同细胞进行裂解并进行IP实验发现，ECT2的敲低导致泛素化USP7水平的增加。免疫沉淀分析显示泛素化 Myc-USP7蛋白的水平在ECT2高表达细胞中明显降低。作者同时也证明内源性USP7的泛素化水平在ECT2缺陷细胞中升高，而在ECT2过表达细胞中降低。

研究结论：ECT2通过抑制其多泛素化功能控制USP7的蛋白稳定性，并且细胞核GEF/GTPase信号不参与这个过程。

4.ECT2 促进USP7分子间自缔合、去泛素化和稳定化     

        作者认为ECT2促进的USP7稳定可能是通过增强USP7与其他去泛素化酶的关联或保护它免受 E3 连接酶的泛素化。作者研究ECT2 是否在此过程中起作用。作者首先验证了USP7能够与自身相互作用，表现为 Myc-USP7可以被 FLAG-USP7有效地免疫沉淀）。蛋白质印迹分析表明，在 GFP-USP7/wt 稳定表达细胞中，随着诱导USP-7的表达量提高，而内源性USP7的 mRNA 表达未通过 qRT-PCR 检测而改变。这些结果表明USP7与自身相互作用并使其自身稳定。接下来，作者检查了USP7是否控制其自身的泛素化。USP7/wt 的表达显着降低了泛素化USP7/C223S 物种的水平。因此，USP7可能会从自身去除多聚泛素缀合物以保持其蛋白质丰度。

        为了研究ECT2在USP7自我调节中的作用，作者首先将对照 siRNA 或ECT2siRNA 转染到表达 GFP-USP7和 mCherry-LacI-USP7的 LacO 细胞中。共聚焦显微镜分析表明ECT2敲低极大减少了 GFP-USP7和 mCherry-LacI-USP7的共定位。此外，作者发现ECT2过表达促进了这种效果。结果表明ECT2在促进USP7自关联方面发挥着重要作用。与体内去泛素化试验的结果一致，使用 Sf9 细胞纯化的USP7和 His-Ub 偶联的USP7/C223S 的体外去泛素化试验表明ECT2添加显着促进USP7自去泛素化。另一方面作者发现ECT2敲低削弱了由 GFP-USP7的强制表达诱导的内源性USP7的上调。

研究结论：ECT2可以促进USP7分子间自缔合、去泛素化和稳定化，并且这些作用与ECT2 GEF活性无关。

5.USP7稳定ECT2      

        为了进一步探究USP7和ECT2之间物理相互作用的功能意义，作者检查了USP7对ECT2表达的影响。在USP7敲低的 MCF-7 细胞和 MDA-MB-468 细胞中ECT2的水平显着降低，而ECT2的 mRNA 表达水平不受USP7敲低的影响。为了进一步支持这一推论，通过放线菌酮 (CHX) 追踪分析评估了USP7调节ECT2蛋白稳态水平的潜力。蛋白质印迹分析显示USP7敲低明显与ECT2的半衰期缩短有关。这些观察结果表明ECT2是USP7的潜在底物。为了获得对USP7和ECT2之间功能联系的分子机制，作者探究了USP7促进的ECT2稳定性是否取决于其泛素特异性蛋白酶活性。用USP7的抑制剂导致ECT2的蛋白质水平呈剂量依赖性降低，而对其mRNA 水平没有影响。此外，USP7敲除细胞中ECT2的下调可以通过USP7/wt 的强制表达完全恢复。这些结果支持USP7通过USP7去泛素化酶活性调节ECT2稳定性的论点。

        鉴于ECT2是一种泛素化蛋白并且USP7促进了ECT2的稳定化，作者接下来探究USP7是否具有去泛素化ECT2的功能。首先，作者表明USP7的敲低导致泛素化ECT2物种水平的增加。然后，作者发现USP7过表达与泛素化ECT2物种水平降低有关。与USP7的酶抑制导致ECT2不稳定的观察结果一致，用USP7抑制剂 GNE-6640 处理 HeLa 细胞 4 小时导致泛素化ECT2物种水平显着增加和总ECT2减少。接下来，作者通过体外去泛素化分析表明，USP7/wt 能够去泛素化 ECT2，而USP7/ C223S 不行。这些结果表明USP7靶向ECT2进行去泛素化，表明ECT2是USP7的真正底物。

研究结论：ECT2和USP7在控制彼此稳定方面形成正反馈调节回路。

6.MDM2是ECT2/USP7回路的关键下游效应器     

        作者采用RNA-seq 来表征可能有助于ECT2促进乳腺癌发生的候选效应子或效应子相关信号通路。作者鉴定了 365 个在ECT2和USP7耗尽细胞中表达发生改变的基因，发现几乎所有这些基因都聚集为由ECT2和USP7以相同方向转录调节的靶标，支持了ECT2和USP7的功能与彼此相互作用。由ECT2和USP7共同调节的基因随后被分类为各种信号通路。     

        作者接下来选择了几个代表性基因并通过 qRT-PCR 验证了它们在 MCF-7 细胞中的表达。结果表明，在敲低ECT2或USP7后，MDM2、p21、PUMA、TP53INP1、TP53INP2、GDF15 和 IGFBP3 的 mRNA 水平升高，尽管程度不同，而 TP53 的表达没有变化。这些结果表明 p53 信号通路在ECT2或USP7缺陷细胞中被激活。作者接下来想知道 p53 是否是 ECT2/USP7调节下游效应所必需的。作者通过敲除P53并重新表达，发现ECT2敲低相关的MDM2不稳定可以通过USP7在这些细胞的每种类型中的重新表达来恢复。与USP7减少相关的ECT2缺陷在很大程度上被USP7的重新表达所回补。总的来说，这些结果表明ECT2在MDM2稳定中的参与取决于USP7，并支持 ECT2/USP7前馈调节回路在促进 p53 熟练和 p53 缺陷细胞中MDM2稳定方面发挥关键作用的观点。

        为了进一步研究该电路的生物学意义，进行了群落形成试验。结果表明，ECT2缺失相关的乳腺癌细胞生长迟缓可以在一定程度上通过强制表达MDM2或USP7/wt逆转。然后，作者检查了MDM2和USP7在 MDA-MB-468 异种移植肿瘤样品中的表达。结果表明ECT2敲低与MDM2和USP7的下调有关。为了将作者的观察扩展到临床病理学相关的背景，作者随后分析了 ECT2、USP7和MDM2的蛋白质表达水平与乳腺癌样本和组织学上正常的乳腺组织。作者发现，当根据免疫阳性的平均强度程度对染色进行分析时，ECT2 和USP7连同MDM2在乳腺癌样本中高度表达，并且它们的表达水平彼此相关。

研究结论：ECT2/USP7回路可能与乳腺癌发生有关，并且ECT2与USP7协调以促进乳腺癌细胞存活。

结论与讨论

        在这项研究中，作者揭示了ECT2在促进乳腺癌发生中以GEF活性非依赖的方式发挥作用。具体来说，作者发现ECT2和USP7形成一个正反馈回路，其中ECT2促进USP7分子间自缔合、去泛素化和稳定化，反过来，USP7去泛素化和稳定ECT2。该回路最终通过维持致癌蛋白MDM2的表达来促进乳腺癌细胞的存活。

Thank you!

原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7482815/