【普鲸甲基化小讲堂】第8讲 - 甲基化检测技术略略略……
小伙伴们大家好啊！从今天这一讲开始，普鲸君就和大家一起来学习DNA甲基化检测技术的方方面面。
今天我们先做一个简要的回顾，按照时间由远及近把DNA甲基化检测历史上一些重要的节点列出来。需要说明的是不是普鲸君偷懒，而是我们只把一些重要的、有代表性的方法列出来了哦，相信通过这个简要的回顾，我们就可以对甲基化检测有了一个大致的了解。
1992年 --- 重亚硫酸盐处理甲基化样本
就是俗称的BS转化啦！BS是单词bisulfite的简写。这里用到了“转化”这个词，说的就是经处理后可以将未甲基化的胞嘧啶C“转化”为尿嘧啶U，最后经PCR扩增“转化”为胸腺嘧啶T，而发生甲基化的5mC则得以保留下来。
2003年 --- 焦磷酸测序
焦磷酸测序主要用于甲基化位点的验证，它简单来说就是重亚硫酸盐修饰+PCR扩增=焦磷酸测序仪，特点是准确度高，BS焦磷酸测序已经成为验证甲基化的金标准了。
2005年 --- MeDIP-seq、RRBS、NGS
MeDIP-seq的全称是Methylated DNA immunoprecipitationsequencing，即甲基化DNA免疫共沉淀测序。它是基于抗体富集原理的，特异性地收集基因组上发生甲基化的片段后再进行测序。MBD-seq（Methylated DNA binding domain sequencing）可以看做是它的同类，这是只受甲基化结合蛋白与DNA的结合区域。
RRBS全称是Reduced representation bisulfite sequencing，即简化表观亚硫酸盐测序法。它是依赖于甲基化位点敏感的限制性酶切法的一种方法，使用MspI对基因组进行酶切，从而将CpG富集出来，它所覆盖的CpG位点由酶切位点“CCGG”决定，随着片段分选大小而动态变化。后来人们对其也进行了一些扩展，如双酶切RRBS、激光捕获显微解剖RRBS等，但基本原理都是实验室酶切，这一点就限制了RRBS的应用。
另外，别忘了从这一年开始，二代测序技术登上了历史的舞台，从此以后甲基化检测与NGS技术进行了结合，诞生出诸多的新技术新应用。
2007年 --- 27k芯片
这是由Illumina公司推出的第一款甲基化检测芯片，全称是Infinium Human Methylation 27 Beadchip，因为它有约27，578个CpG位点的探针对，因此简称27k。在当时来说收录的甲基化位点已经很多了，现在我们逛TCGA数据库时还会见到它的踪影。我们现在提到Illumia公司往往容易想到高通量测序，但殊不知它的起家产品却是基因芯片。
2009年 --- WGBS
WGBS是大家耳熟能详的，全基因组测序（WGS）+BS转化=WGBS。它理论上适用于任何物种，需要的input DNA数量也很多，常规是μg级别的，经过改进后，仅需1ng即可进行检测，但是其效果却还不是很让人满意。我们都知道亚硫酸氢盐转化过程中对DNA的处理是一种很剧烈的过程，因此会损失掉诸多有用的信息，并且它费用高昂，是已知同类高通量检测甲基化技术中最为昂贵的。
2011年 --- 450k芯片
随着NGS技术被用于甲基化检测，已知的人类DNA上甲基化位点数量剧增，因此Illumina升级了27k芯片，推出Infinium HumanMethylation450 BeadChip，它可以检测482，421个CpG位点和3，091个非CpG胞嘧啶，俗称“450k”，在甲基化检测市场里这款产品长期以来都是大家的首选，把同类的其它芯片产品打得落花流水已在江湖上销声匿迹了。
2012年 --- oxBS-seq、TAB-seq与5hmC
这是两类检测5hmC的方法。oxBS-seq是Oxidative bisulphatesequencing，氧化重亚硫酸盐测序。TAB-seq是TET-assisted bisulphatesequencing，TET协同的亚硫酸氢钠法测序。
2013年 --- SureSelect甲基化捕获技术
Agilent公司在这年推出了自己的甲基化捕获产品Agilent SureSelect MethylSeq Kit，它是采用先捕获再BS转化的方法来获取甲基化位点的信息。然后用NGS进行测序检测，它在检测通量上仅比WGBS低，远远高于450k（及后面要提到的850k）芯片，也不像RRBS那样具有位置偏好性，是一款性价比极高的甲基化检测产品。
2016年 --- 850k（EPIC）芯片
这年年底，Illumina公司在忙着生产测序仪的同时还不忘更新自己的芯片产品，推出了甲基化芯片3.0升级版Infinium HumanMethylationEPIC BeadChip，可检测约约853,307个CpG位点，因此也被大家称为“850k”芯片。普鲸君的大家庭每年光用它就要检测上万例的样本呢。
2019年 --- TAPS技术与定制化捕获
以往检测甲基化都要用到BS转化，它虽然有着一些缺陷，但瑕不掩瑜，还是打败了其它的样本处理技术。但是就在2019年2月，一位新的挑战者诞生了，它就是TAPS（TET-assisted pyridine borane sequencing，TET辅助吡啶**测序）。与BS测序相比，TAPS无需亚硫酸氢盐，可对目标序列直接进行DNA甲基化测序，是一种破坏性更小、效率更高的单碱基分辨率DNA甲基化测序方法。它相较BS转化而言采用了一种“反其道而行之”的策略，可在不影响未修饰胞嘧啶的前提下，实现5mC和5hmC的直接检测。现在这一方法已经被初创公司用于商业化开发癌症液体活检早筛产品了。
而也是在这一年，Twist、Qiagen两家公司分别推出了各自的定制化甲基化捕获试剂盒。它们都是采用先BS转化再捕获的策略，因此需要的input DNA量更低，数十ng即可检测，因此在临床上更适用于血液检测cfDNA。癌症早筛领域大热的Grail公司所采用的检测技术即是Twist的甲基化定制技术。
虽然说了这么一大段，但普鲸君意犹未尽，也确实没有把技术介绍得全面，一方面是我们课堂时间有限不能把每一项技术都详细展开介绍，另一方面就是很多技术（如MBD-seq等）现在应用得越来越少，便就略过不提。
以后的几讲里，我会详细地介绍常用的甲基化检测技术给大家，今天的课程就到此为止吧。下课喽！
