TRPV1研究进展盘点

 

纳米粒子介导的TRPV1通道阻断通过

热休克因子1调制放大癌症热免疫疗法

发表期刊：Nature Communications

影响因子:（2021IF：17.6939，JCRQ1）

发表时间：2023年4月23日

作者：Huabing Chen教授

4T1、HCT116、HEK293T-EGFP、PANC02细胞购自逸漠生物(IMMOCELL)

研究背景

恶性肿瘤的存活高度依赖于其内在的自我防御途径，例如癌症治疗期间的热休克蛋白(HSP)。然而，精确拆除自我防御以增强抗肿瘤效力仍未得到探索。

摘要部分

在此，研究人员证明纳米颗粒介导的瞬时受体电位香草素成员1(TRPV1)通道阻断通过抑制热休克因子1(HSF1)介导的双重自卫途径来增强热免疫疗法。TRPV1阻断抑制热疗诱导的钙内流和随后的HSF1核转位，从而选择性地抑制应激性过度表达的HSP70，以增强对各种原发性、转移性和复发性肿瘤模型的热疗效果。特别是，抑制HSF1易位进一步抑制转化生长因子β(TGFβ)途径降解肿瘤基质，从而促进抗肿瘤治疗药物（例如抗PD-L1抗体）和免疫细胞向高度纤维化和免疫抑制的胰腺癌的浸润。结果，TRPV1阻断恢复了具有可根除肿瘤和免疫记忆效应的热免疫疗法。纳米粒子介导的TRPV1阻断代表了一种有效的方法来消除有效癌症治疗的自我防御。

研究内容

1. TRPV1阻断或敲低增强热细胞毒性

为了产生有效的热疗以产生癌症热疗，白蛋白纳米颗粒笼罩硫化铜纳米晶体（CuSNCs）被构建为如前所述的光热源，其具有7.8nm的核心尺寸和25.4nm的流体动力学直径。在近红外光照射下，这些CuS-NCs在浓度为1.0mMCu的情况下，在300s内表现出浓度依赖性温度升高约30°C，显示出明显的光热转换能力，由于显着的近-红外吸收。为了评估TRPV1阻断对热疗介导的CuS-NC细胞毒性的影响，将特异性TRPV1拮抗剂SB705498应用于同时用CuS-NC处理的野生型A549(A549-WT)细胞，然后5分钟1.5Wcm.2的光暴露和随后使用MTT测定法评估对A549-WT细胞的光细胞毒性。在没有光照的情况下与SB705498或CuS-NC孵育后，A549-WT细胞的活力保持相对不变。

然而，在来自CuS-NCs(0.2mM)的热疗后，SB705498(0-20nM)显示出细胞毒性的浓度依赖性改善，与20nMSB705498相比，40nMSB705498没有引起细胞毒性的明显增加。在随后的实验中，使用20nMSB705498阻断TRPV1离子通道以增强热细胞毒性。在存在SB705498的情况下，来自CuS-NC的热疗在光照下的IC50为0.25mM，而在没有SB705498的情况下在光照下观察到IC50明显增加（0.39mM）（图1a）。同时，还发现SB705498通过增加细胞培养温度来放大热疗介导的细胞损伤。这些结果表明，SB705498介导的TRPV1阻断是热细胞毒性明显改善的原因。此外，5-乙炔基-20-脱氧尿苷(EdU)染色经常用于通过监测绿色荧光检测S期增殖细胞，以验证SB705498介导的TRPV1阻断改善CuSNC热细胞毒性的能力.在没有光照的情况下，无论是否结合SB705498，CuS-NC都不会对A549-WT细胞增殖造成损害。相反，在光照下，SB705498明显促进了基于热疗的细胞毒性，绿色荧光强度最低，表明S期增殖细胞较少。因此，SB705498介导的TRPV1阻断显着改善了热疗时的热细胞毒性。

为了验证TRPV1阻断与热疗的协同作用，研究人员使用带有绿色荧光蛋白(GFP)标签的TRPV1shRNA建立了稳定的A549-TRPV1敲低(A549-TRPV1KD)细胞。如图1b，超过90%的细胞呈GFP阳性，A549-TRPV1KD细胞中的TRPV1表达水平明显低于A549-WT细胞，证实了有效的敲低TRPV1。然后，MTT测定显示来自CuS-NCs的热疗具有比A549-TRPV1KD细胞(0.20mM)高1.7倍的IC50值0.35mMinA549-WT细胞（图1c）。然而，A549细胞中TRPV1离子通道的过表达大大降低了CuS-NC的热细胞毒性，IC50值为0.45mM。这些结果表明，肿瘤细胞中TRPV1的敲低明显促进了热细胞毒性。由于A549-WT和A549-TRPV1KD细胞对CuS-NC的细胞摄取相似，因此肿瘤细胞中TRPV1通道的敲低合理地参与了热疗介导的热细胞毒性的增强。

由于TRPV1阻断有效地协同热疗效率，研究人员进一步探索了SB705498作为TRPV1拮抗剂逃避热阻的机制。TRPV1通道作为主导钙内流的温度敏感钙离子通道，参与细胞内信号转导。因此，研究人员假设Ca2+流入可能在热疗过程中发挥重要作用，这可能与HSF1核易位和随后的应激性HSP70上调有关（图1d）。为了清楚地观察各种处理后Ca2+的流入，使用了红色荧光Ca2+结合染料(CalciFluorTM Rhod-4,AM)。CuS-NCs的热疗诱导A549-WT细胞中细胞内Ca2+的急剧增加，如红色荧光强度显着提高（比PBS组高7.9倍）所示，而SB705498或TRPV1敲低对TRPV1的阻断明显抑制这种细胞内Ca2+增加（图1e）。为了进一步验证Ca2+流入是否依赖于细胞外Ca2+，研究人员利用细胞外Ca2+螯合剂乙二醇-双（2-氨基乙醚）-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)来清除细胞外Ca2+在介质中。

显然，清除细胞外Ca2+导致红色荧光的增加可忽略不计，表明Ca2+流入对细胞外Ca2+的特定依赖性（图1e）。此外，使用CalciFluorTMRhod-4，AM探针对来自细胞内Ca2+的红色荧光进行流式细胞术分析，进一步证实了TRPV1阻断或敲低抑制Ca2+流入的能力。因此，热疗敏感地激活TRPV1通道介导的Ca2+流入（图1d），这明显不利于热细胞毒性，而这种Ca2+流入也能够被TRPV1阻断有效抑制。

研究人员使用MTT法进一步证明了Ca2+流入对CuS-NCs的热细胞毒性的影响，其中无毒的EGTA作为钙清除剂在2.0mM的剂量下导致CuS-NCs在高温下的IC50约为0.24mM,优于单独热疗的细胞毒性(~0.35mM)。因此，使用EGTA清除细胞外Ca2+表现出与无毒SB705498相似的行为，如图1a所示。之后，EdU染色进一步显示，与光照下单独的热疗相比，EGTA存在下的热疗对细胞增殖产生更好的抑制作用，证实通过TRPV1通道阻断Ca2+流入能够增强热细胞毒性。

随后，还利用流式细胞术评估不同处理下A549-WT细胞的凋亡。单独的CuS-NCs介导的热疗引起62.3%的细胞凋亡水平，而通过TRPV1拮抗剂SB705498或钙螯合剂EGTA有效抑制Ca2+流入导致光照下CuS-NCs在热疗下细胞凋亡明显增加(75.2%)，表明热疗激活的Ca2+内流明显损害热疗效率。此外，蛋白质印迹也用于验证细胞凋亡行为，与SB705498、EGTA或TPRV1敲除相比较，在CuS-NCs介导的热疗下观察到A549-WT细胞裂解的caspase-3表达增强仅在热疗下。值得注意的是，TRPV1阻断协同热细胞毒性并通过有效阻断Ca2+流入促进肿瘤细胞凋亡。

进一步阐明抑制Ca2+流入热疗引起的协同机制，其中Ca2+可能与细胞热休克反应有关，包括热休克转录因子1(HSF1)易位到细胞核，以及随后的应激HSP7029的转录和最终翻译。因此，研究人员应用免疫荧光染色来评估TRPV1阻断在干扰CuS-NC引起的高温下肿瘤细胞的核内HSF1易位和细胞内HSP70表达中的作用。单独的热疗导致HSF1明显的核转位，HSF1和细胞核的共定位率为84.6%（图1f），随后HSP70在A549-WT细胞中过表达（图1g）,表明热疗特别激活应激性HSP70表达。同时，发现SB705498共孵育或TRPV1敲低明显阻断HSF1核转位，共定位率分别为24.4%和35.6%（图1f），并抑制热疗下应激性HSP70上调，分别与核内HSF1和细胞内HSP70水平相关的几乎不变的荧光信号证明了这一点（图1g）。特别是，为了验证Ca2+流入的阻断是否解释了HSF1易位和应激性HSP70上调的抑制，EGTA(2.0mM)也用于清除培养基中的Ca2+。EGTA明显抑制HSF1的核内转位和A549-WT细胞在光照射下来自CuS-NC的热疗下应激性HSP70上调（图1f、g），类似于SB705498的行为。此外，还使用蛋白质印迹验证了TRPV1阻断抑制HSF1核内易位和随后热疗后应激性HSP70上调的能力。与仅从CuS-NCs接受热疗的A549-WT细胞相比，TRPV1阻断和敲低均导致核内HSF1表达的显着降低，这解释了应激性HSP70的有效下调.这些结果证明了TRPV1阻断或敲低抑制HSF1核内易位以下调应激性HSP70，最终协同热疗的能力。

为了研究SB705498介导的TRPV1阻断对体内热疗效力的协同作用，将A549-WT细胞或A549-TRPV1KD细胞皮下注射到裸鼠体内，分别建立A549-WT肿瘤或A549-TRPV1KD肿瘤模型。值得注意的是，在注射A549-WT或A549-TRPV1KD肿瘤的小鼠中，在注射后24小时，肿瘤积聚相似，约为7.2%IDg.1，剂量为30.0μmolkg的CuS-NC.1Cu在注射后24小时光照下导致A549-WT和A549-TRPV1KD肿瘤在5分钟内温度升高(ΔT)~12.8°C和~12.6°C（图1h),分别表明CuS-NCs在两种肿瘤模型中引起相似的热疗。为了触发体内热疗，将CuS-NCs以30.0μmolkg.1的剂量静脉注射到携带皮下A549-WT和A549-TRPV1KD肿瘤的小鼠体内，然后将小鼠暴露于785nm光照射（5分钟，1.5Wcm.2)在注射后24小时。同时，SB705498（1.0mgkg.1）在照射前30分钟进行肿瘤内注射，以在A549-WT肿瘤模型中诱导TRPV1阻断，然后在注射后30天内监测肿瘤体积。PBS组中携带A549-WT肿瘤和A549-TRPV1KD肿瘤的小鼠表现出相似的肿瘤生长曲线，在30天内增加了约15.0倍（图1i），表明TRPV1通道本身没有影响在非高温条件下对肿瘤生长的影响。TRPV1敲低对肿瘤生长的影响可以忽略不计，可能是由于相对较短的监测期。有趣的是，在CuS-NCs热疗后，A549-WT肿瘤被迅速消融，但随后在照射后14天出现明显复发（图1i），表明仅热疗难以根除肿瘤由于肿瘤细胞对热疗的抵抗力。重要的是，在TRPV1阻断或敲低后，来自CuS-NC的热疗完全消除了肿瘤，没有任何复发和可忽略不计的体重变化（图1i），这进一步通过对肿瘤的严重组织学损伤和通过苏木精和伊红(H&E)染色和Ki67染色有效抑制细胞增殖。特别是，TRPV1阻断和敲低都产生了类似的协同能力，证实TRPV1阻断在对抗癌症热疗中的热阻方面起着至关重要的作用。此外，在没有光照射的情况下，CuS-NCs对两种肿瘤模型的肿瘤生长也没有影响（图1i），表明来自光可激活的CuS-NCs的热疗确保了针对肿瘤细胞的选择性热疗。

研究人员接下来使用免疫荧光染色研究了高温下A549-WT和A549-TRPV1KD肿瘤模型中应激性HSP70的体内表达。对于单独的CuS-NCs介导的热疗，观察到来自肿瘤切片HSP70表达的明显红色荧光，这明显高于没有热疗的情况，表明热疗后肿瘤在体内产生应激性HSP70（图1j）。重要的是，使用SB705498或TRPV1敲低的TRPV1阻断有效地抑制了肿瘤切片的体内应激HSP70表达，同时对正常表达的HSP70没有明显影响（图1j）。这表明TRPV1阻断特异性地抑制了应激性HSP70在肿瘤部位的体内表达。TUNEL染色还用于评估TRPV1阻断对热疗后A549-WT和A549-TRPV1KD肿瘤模型的肿瘤体内损伤的影响。在没有热疗的情况下，对于TRPV1敲低观察到可忽略的红色荧光，表明TRPV1通道本身对肿瘤细胞凋亡的无毒特性（图1j）。单独的热疗在肿瘤切片中引起明显的细胞凋亡行为，增强的红色荧光证实了这一点，而SB705498或TRPV1敲低进一步放大了热疗引起的肿瘤切片的细胞凋亡水平（图1j）。SB705498介导的TRPV1阻断通过阻断Ca2+流入以限制HSF1的核转位和应激性HSP70过表达来增强热疗损伤（图1d）。

图1.TRPV1阻断或敲低通过阻断Ca2+流入和抑制HSF1核转位以抑制应激性HSP70上调来增强热疗效果

研究结论：TRPV1阻断或敲低通过阻断Ca2+流入和抑制HSF1核转位以抑制应激性HSP70上调来增强热疗效果。TRPV1阻断通过阻断Ca2+流入和抑制随后的HSF1核易位介导的应激性HSP70上调来放大热细胞毒性。TRPV1阻断或敲低可有效增强体内热疗功效。

2. 转录组分析揭示了TRPV1阻断和热疗之间的潜在协同作用

为了彻底研究TRPV1阻断对热疗的影响，在用CuS-NCs介导的热疗和SB705498处理后对A549-WT细胞进行了转录组分析。明显地，发现了热疗组合的23个上调基因和30个下调基因根据主成分分析和聚类分析，TRPV1阻断与PBS相比（图2a，P<0.05且倍数变化≥2）。如图2b所示，与PBS相比，对于TRPV1与热疗的协同作用，观察到负责调节下游基因表达的4932个初级转录物的明显差异。此外，基因本体论(GO)分析显示，这53个明显可变的基因与生物过程、分子功能和细胞成分密切相关（图2c）。其中，那些与结合相关的基因可能与癌细胞凋亡和迁移有关，揭示了TRPV1阻断协同热疗的强大能力。在图2d中，使用Search Tool for the Retrieval of InteractingGenes/Proteins(STRING)网络分析来确定不同的蛋白质-蛋白质相互作用，发现六种功能蛋白主要参与细胞钙离子稳态、细胞热反应、细胞分化、蛋白质代谢过程和细胞凋亡过程的调控。此外，京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析表明，这些可变基因与几种特定的细胞内通路特别相关，包括Nrf2介导的氧化应激反应，与外部热疗刺激、p53信号传导、上皮间充质转化(EMT)的调节有关途径和抑制与肿瘤迁移密切相关的基质金属蛋白酶，表明TRPV1阻断有效调节细胞凋亡并可能抑制肿瘤转移（图2e）。

图2.TRPV1阻断与热疗协同作用的转录组分析

研究结论：因此，转录组分析表明，TRPV1阻断和温热疗法之间的协同作用与细胞凋亡、迁移和转移高度相关。

3. 纳米颗粒介导的TRPV1拮抗剂靶向递送用于选择性TRPV1阻断协同热细胞毒性

TRPV1阻断被鉴定为通过肿瘤内TRPV1拮抗剂(SB705498)与CuS-NCs触发的热疗的组合诱导增强的癌症热疗，如上所示。为了实现TRPV1拮抗剂与热疗的合理协同作用，研究人员使用聚（乙二醇）114-bpoly构建了载有ICG/SB705498的聚合物胶束（IS-Micelles，载药效率分别为7.5%ICG和5.0%SB705498）（己内酯）60(PEG114-PCL60)作为载体，它们有望通过静脉注射将TRPV1拮抗剂和光热ICG同步共同递送到肿瘤中（图3a）。ISM胶束的透射电子显微镜(TEM)直径分别为~42.8nm和流体动力学直径~75.6nm（图3b）。载有ICG的聚合物胶束（在TEM中直径为43.2nm的I-胶束）被制造为仅具有热疗功能的对照。为了确认IS-胶束产生热疗的能力，在光照（785nm，1.5Wcm.2）下5分钟内监测温度升高。这些胶束表现出明显的浓度依赖性温度升高（图3c），这合理地归因于它们22.7%的高光热转换效率。此外，IS-胶束在pH7.4时表现出相对较低的SB705498释放，而在pH6.5和5.5时观察到SB705498从IS-胶束释放增加，这是由于SB705498在酸性pH下的溶解度增加（图3d），从而有助于肿瘤微环境可激活释放以有效阻断TRPV1。

然后研究人员评估了4T1-Luc三阴性乳腺癌(TNBC)细胞对IS-胶束的细胞摄取，这些细胞具有与A549-WT细胞相似的TRPV1通道表达水平。IS-胶束通过网格蛋白介导的内吞途径表现出ICG的时间依赖性摄取，氯丙嗪处理后ICG的细胞摄取减少证明了这一点。特别是，研究人员使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进一步评估了IS-胶束的细胞内分布。观察到IS-胶束与溶酶体的共定位率为94.8%，但由于溶酶体膜破裂和随后的细胞质易位，在光照下降低至18.9%。合理地，来自ISM胶束的活性氧物质(ROS)的有效产生解释了溶酶体膜的破坏，正如在光照下孵化IS-胶束后它们的二氢乙锭(DHE)染色具有明显的红色荧光所证实的。此外，使用吖啶橙(AO)染色进一步验证了IS-胶束破坏溶酶体膜的能力，光照射后溶酶体中的红色荧光完全消失。为了验证IS-Micelles阻断TRPV1的能力，研究人员首先使用Fluo-8使用CLSM监测细胞内Ca2+积累。显然，由于通过TRPV1阻断抑制Ca2+流入，IS-胶束在光照射下显示出比I-胶束低得多的绿色荧光信号。因此，有效的细胞摄取、细胞质易位和pH响应释放可能会促进SB705498从IS-胶束到TRPV1通道的可及性，以实现有效的TRPV1阻断。

为了证实IS-胶束阻断TRPV1协同热疗的能力，通过MTT测定评估热细胞毒性，IS-胶束和I-胶束的IC50分别为～6.8μgmL.1和～8.4μgmL.1（图3e)。EdU染色进一步表明，与光照射下的I-胶束相比，IS-胶束对细胞增殖的抑制效果更好（图3f，g）。此外，研究人员应用HSF1和HSP表达的免疫荧光染色来验证靶向共递送策略是否可以有效克服热疗期间的热阻。显然，在光照射下IS-胶束的热疗观察到细胞核中HSF1的红色荧光可忽略不计，而作为对照的I-胶束显示由于缺乏TRPV1阻断而导致HSF1明显的细胞质易位到细胞核中（图3h)。从而导致应激性HSP70明显上调（图3i，j）。相比之下，通过TRPV1拮抗剂的有效共递送，IS-胶束组中的肿瘤细胞与照射后的PBS相比没有显示明显的HSP70表达变化（图3i，j），表明ISMicelles是能够通过有效的TRPV1阻断来阻止应激性HSP70过表达以克服耐热性。此外，流式细胞术用于通过AnnexinV-FITC/PI染色评估细胞凋亡行为。IS-胶束导致约71.7%的细胞凋亡，与单独热疗的I-胶束(59.4%)相比，显示出更好的热细胞毒性（图3k，l），这也通过HSP70表达降低得到证明并在蛋白质印迹中明显上调裂解的caspase-3。

图3.使用聚合物胶束共同递送TRPV1拮抗剂和光热剂可实现TRPV1阻断协同热细胞毒性

研究结论：这些数据清楚地表明，IS-胶束的共递送策略成功地促进了TRPV1阻断以克服热阻，通过提高SB705498对TRPV1通道的可及性来增强它们的热细胞毒性。

4. TRPV1阻断协同热疗通过靶向递送IS-胶束在体内抑制原发性、转移性和复发性TNBC肿瘤

为了证明IS-Micelles对TNBC的协同抗肿瘤功效，研究人员首先通过静脉注射7.5mgkg.1ICG和5.0mgkg剂量的IS-Micelles评估了它们在携带原位4T1-Luc乳腺肿瘤的小鼠中的生物分布。1SB705498。注射后24小时后，IS-胶束和I-胶束在肿瘤部位均表现出约2.6%IDg.1的有效肿瘤生物分布（图4a），这与光照射下约13.0°C的可比热疗有关（图4b)。然后，研究人员使用初级抗N-钙粘蛋白初级抗体和Alexa Fluor488偶联二级抗体通过肿瘤细胞膜染色评估了IS-胶束的体内肿瘤微分布。观察到IS-胶束在肿瘤基质和细胞内空间的均匀分布，证实了TRPV1拮抗剂和光热剂深入和均匀地渗透到肿瘤中。此外，研究人员通过免疫荧光染色研究了IS-胶束的渗透深度血小板和内皮细胞粘附分子1(PECAM-1)一抗和AlexaFluor488偶联二抗。由于尺寸分布合适，IS-胶束在小4T1肿瘤（~75mm3）中表现出相当大的外渗和约100μm的深穿透深度。由于高渗透性4T1肿瘤中的丰富血管，IS-胶束在大型4T1肿瘤（~250mm3）中仍然表现出均匀和深度的渗透，与小型4T1肿瘤中的ISM胶束相当。

为了探索TRPV1阻断与温热疗法的体内协同作用，将IS-胶束以7.5mgkg.1ICG和5.0mgkg.1SB705498的单剂量给药到原位4T1-Luc乳腺肿瘤荷瘤小鼠中，然后用光曝光(785nm,1.5Wcm.2)5分钟，随后在注射后21天内测量肿瘤体积。无论光照如何，PBS观察到肿瘤体积增加约47.5倍，ISMicelles和I-Micelles组中没有照射的小鼠也显示出与PBS相似的肿瘤生长，正如它们的生物发光图像所验证的那样（图4c，d）。重要的是，IS-Micelles导致肿瘤完全根除，照射后没有任何再生，而单独热疗的I-Micelles由于注射后7天肿瘤快速复发，肿瘤体积增加了约14.9倍（图4c，d）.此外，实验结束时小鼠的肿瘤重量进一步证实了与I-胶束相比，ISMicelles具有更好的抗肿瘤功效（图4e）。值得注意的是，TRPV1阻断策略在通过照射肿瘤上的IS-胶束来根除从过热中幸存的肿瘤细胞方面显示出明显的优势。为了进一步证实TRPV1阻断与温热疗法的协同作用引起的肿瘤损伤，在照射后6小时收集遭受不同治疗的4T1-Luc乳腺肿瘤用于随后的组织学、Ki67和TUNEL染色。光照射后，与I-胶束相比，IS-胶束表现出更严重的组织学损伤、更少的细胞增殖和更好的细胞凋亡。

特别是，在该实验结束时同时观察到肺部4T1-Luc转移性结节的生物发光。由于有效根除原发性肿瘤，IS-胶束完全根除了肺部的转移性结节，而I-胶束在原位4T1-Luc肿瘤的肺部产生了显着的转移性结节（图4f，g）。此外，进一步应用H&E染色以验证它们通过IS-胶束处理对肺部转移性结节的有效抑制，而I-胶束仍观察到一些转移性结节（图4f，g）。显然，TRPV1阻断在有效抑制远端转移性结节方面起着至关重要的作用，因为它们参与了EMT通路的调节（图2e），尽管IS-胶束仅在原发性肿瘤处发挥局部热疗作用。

受ISMicelles相当大的热疗功效的启发，研究人员进一步评估了它们对术后失败的原位TNBC的抗肿瘤功效。简而言之，手术切除用于消融原位4T1-Luc乳腺肿瘤，以提供初始手术治疗。然后，在手术后7天，给予单剂量7.5mgkg.1DOX、7.5mgkg.1ICG或5.0mgkg.1SB705498的游离多柔比星(DOX)、I-胶束和IS-胶束通过静脉注射分别提供针对复发肿瘤的术后化疗或热疗（图4h）。手术切除后，除PBS作为对照外，所有治疗组均观察到可忽略不计的生物发光，表明原位肿瘤手术切除成功（图4i)，但术后7天有明显的肿瘤复发。与单独的手术切除相比，发现来自DOX的化学疗法抑制复发性肿瘤的生长，然而，肿瘤生长仍然具有侵袭性。重要的是，与仅来自I-胶束的热疗相比，来自IS-胶束的TRPV1阻断协同热疗导致了对复发性肿瘤的有效抑制，实验结束时生物发光信号和肿瘤重量的减少证明了这一点（图4i）,j)，进一步验证了TRPV1阻断和热疗之间的明显协同作用。还在化疗后6小时或照射后使用组织学、Ki67和TUNEL染色评估了IS-胶束对复发性肿瘤的光热损伤。与I-胶束和DOX相比，光照射下的IS-胶束表现出更严重的肿瘤细胞损伤、更少的细胞增殖和增强的肿瘤细胞凋亡。

在该实验结束时，研究人员还观察了IS-胶束对源自这些复发性乳腺肿瘤模型的转移性肺结节的影响（图4k，l）。IS-Micelles明显抑制了肺部的转移性结节，而单独使用I-Micelles的热疗显示出更明显的肺转移。相反，与PBS组相比，来自DOX的额外化疗未能产生任何抗转移作用（图4k，l）。此外，H&E染色进一步验证了IS-胶束的更好和有效的抗转移作用，与来自额外的热疗法或化学疗法的那些相比，在肺中具有不可检测的转移性结节（图4k）。这些结果表明TRPV1阻断协同热疗预防肿瘤转移的有效性。

 为进一步阐明IS-Micelles在光照射下预防肿瘤转移和复发的机制，采用细胞划痕实验评估不同处理后肿瘤细胞的转移能力，其中PBS组4T1肿瘤细胞作为对照的距离最小在两个分离的细胞群之间，意味着内在的转移能力。照射后，与I-胶束相比，ISMicelles导致肿瘤细胞迁移减少，表明来自IS-Micelles的TRPV1阻断和热疗协同作用明显减少了细胞转移的发生，可能是由于TRPV1阻断协同热疗参与转移相关的EMT通路（图2e）。因此，IS-胶束通过TRPV1阻断介导的HSP70上调和光照下细胞迁移的抑制，产生更好的抗原发性、转移性和复发性肿瘤的热疗效力。

图4.TRPV1阻断协同热疗使用IS-Micelles有效抑制原发性、转移性和复发性TNBC肿瘤

研究结论：TRPV1阻断协同热疗使用IS-Micelles有效抑制原发性、转移性和复发性TNBC肿瘤。

5. TRPV1阻断通过选择性抑制应激性过度表达的HSP70而具有卓越的安全性，而不会对正常组织造成伤害

正常表达的HSP70作为重要且不可或缺的分子伴侣，可确保准确的蛋白质折叠，从而维持细胞内稳态以抵御外部刺激。为了研究TRPV1阻断的安全性，使用抗HSP70一抗和AlexaFluor594偶联二抗以及常规HSP70抑制剂MKT-077和ICG共包封胶束（IM），应用免疫荧光染色评估HSP70在健康组织中的表达-胶束）作为对照。简而言之，IS-Micelles和IM-Micelles分别以5.0mgkg.1的单剂量静脉注射到健康小鼠体内，然后通过CLSM观察HSP70在不同组织中的表达。显然，在注射后24小时，由于使用MKT-077对HSP70的非选择性抑制，IMMicelles在多个健康组织中引起HSP70表达显着降低，而相比之下，IS-Micelles对所有健康组织中正常表达的HSP70的影响可忽略不计对于PBS组，由于通过TRPV1阻断介导的HSF1核转位抑制选择性下调应激性HSP70（图5a-e），这也通过荧光强度分析得到验证（图5f）。因此，与IM-Micelles相比，IS-Micelles可能具有更高的安全性，因为它对正常表达的HSP70的影响可以忽略不计，显示出安全和选择性抑制压力过表达的HSP70的新兴潜力。

为了确认安全性，研究人员在注射后3天进一步评估了ISM胶束和IM胶束对心脏、肝脏和肾脏功能的影响。因此，IS-胶束对典型的心功能标志物（乳酸脱氢酶、LDH和肌酸激酶、CK）、肝功能标志物（丙氨酸转氨酶、ALT、碱性磷酸酶、ALP和天冬氨酸氨基转移酶、AST）和肾功能标志物的影响可以忽略不计（尿素和肌酐）与PBS处理的小鼠相比，而作为对照的IM-胶束引起明显的心脏、肝脏和肾脏功能标志物变化，因此由于健康组织中正常表达的HSP70不可避免地受到抑制而导致严重毒性（图5g），进一步证明了TRPV1阻断介导的选择性抑制癌细胞内应激性HSP70的良好安全性。为了进一步验证由HSP70抑制引起的并发毒性，应用H&E染色评估组织学损伤。明显地，在IM-Micelles处理的小鼠中观察到严重的心肌纤维化、肝纤维化和出血、脾核收缩、肺纤维化和严重的肾小管损伤如肾小管扩张，而IS-Micelles对组织学形态学变化的影响可忽略不计PBS对照，验证了IS-胶束在同时提高热疗效力和最小化脱靶毒性方面的良好安全性（图5h）。此外，由于严重的多器官组织学损伤，IM-Micelles给药还导致体重持续下降，而IS-Micelles对体重变化的影响可忽略不计（图5i），进一步证实了IS-Micelles在体内癌症中的独特优势治疗。值得注意的是，TRPV1阻断代替HSP70抑制剂，代表了一种革命性的策略，以最小的脱靶毒性增强热疗效果，源于其对健康组织中正常表达的HSP70的干扰可忽略不计（图5j）。

图5.TRPV1阻断赋予卓越的安全性，而不会干扰健康组织中正常表达的HSP70

研究结论：TRPV1阻断通过选择性抑制应激性过度表达的HSP70而具有卓越的安全性，而不会对正常组织造成伤害。

6. TRPV1阻断协同热疗对多种恶性肿瘤产生独特的治疗效果

受到IS-Micelles通过TRPV1阻断协同热疗在TNBC模型中更好的抗肿瘤功效和安全性的启发，研究人员进一步评估了它们对高度侵袭性人类肿瘤模型的治疗效力，这些肿瘤模型也高度表达TRPV1通道，包括HepG2肝肿瘤，MDA-MB-231乳腺肿瘤、HCT-116结肠直肠肿瘤和PNAC1胰腺肿瘤。首先，使用抗TRPV1一抗和AlexaFluor594标记的二抗，应用免疫荧光染色来验证这些恶性肿瘤细胞中TRPV1的表达。在包括HepG2、MAD-MB-231、HCT-116和PANC1癌细胞在内的不同癌细胞系中观察到来自TRPV1通道的显着红色荧光，表明TRPV1通道在这些细胞上大量表达。在所有这些类型的肿瘤细胞中，TRPV1通道主要分布在细胞膜中，如从抗TRPV1抗体（红色）和细胞膜探针（DiO，绿色）合并的明显黄色荧光所示。然后，将IS-Micelles和I-Micelles以7.5mgkg.1ICG或5.0mgkg.1SB705498的单剂量静脉注射到荷载不同肿瘤模型的小鼠体内，随后进行光照（785nm，1.5Wcm.2）在注射后24小时持续5分钟，并测量肿瘤体积以及随后90天内的生存分析（图6a）。临床使用的制剂作为对照也被静脉注射到携带各种肿瘤模型的小鼠中，包括5.0mgkg.1奥沙利铂加7.5mgkg.1DOX、5.0mgkg.1Doxil和7.5mgkg.1伊立替康。在HepG2、MDA-MB-231和HCT-116肿瘤模型中，I-Micelles或IS-Micelles单独显示对肿瘤生长的影响可以忽略不计，在没有光照的情况下与PBS相似，证明I-的无毒特性胶束和IS-胶束。由于化疗细胞毒性，临床使用的制剂分别延迟了肿瘤进展并延长了携带小HepG2、MDA-MB-231和HCT-116肿瘤的小鼠的存活时间（图6b、c）。仅来自I-Micelles的热疗只能明显抑制肿瘤生长并略微延长其生存期，但由于癌细胞固有的耐热性，会发生明显的肿瘤复发。相反，在曝光后，单次注射IS-胶束可完全根除这些恶性肿瘤，在注射后90天内没有任何复发，无论肿瘤模型如何，导致监测期内100%的存活率（图6b、c）。然后，研究人员探索了IS-胶束对大型HCT-116肿瘤模型(250–300mm3)的协同治疗效率。由于TRPV1阻断选择性抑制应激性HSP70的能力，ISMicelles在光照下明显延迟了大型HCT-116肿瘤模型的肿瘤生长，最小的肿瘤体积和延长的存活期证明了这一点（图6d，e）。此外，进一步研究了TRPV1阻断协同热疗法对原位HCT-116-Luc肿瘤模型的抗肿瘤功效（图6a）。显然，在光照射下接受IS-胶束的小鼠显示出最低的生物发光信号和延长的存活时间（图6f-h），验证了更好的抗肿瘤效力。这些结果证实了来自IS-胶束的TRPV1阻断增强针对大型和原位肿瘤模型的热疗的能力。此外，还研究了IS-胶束对难治性PANC1胰腺肿瘤的热治疗效力（图6i）。在没有光照的情况下，与PBS处理的小鼠相比，I-胶束和IS-胶束给药对肿瘤生长的影响可以忽略不计，进一步证明了此类制剂的安全性，而临床使用的Abraxane/吉西他滨(GEM)制剂则受到部分抑制PANC1胰腺肿瘤的进展，但仍显示出侵袭性肿瘤生长，实验结束时的肿瘤重量测量进一步证实了这一点（图6j，k）。重要的是，与I-胶束相比，IS-胶束在光照下对肿瘤生长表现出更严重的抑制作用，但仍然受到不完全消融的影响，这可能是由于它们在渗透性差的胰腺癌中的积累和渗透不足（图6j,k)。

图6.TRPV1阻断协同热疗对多种恶性肿瘤产生更好的治疗效果

研究结论：TRPV1阻断是使用IS-胶束协同热疗的有效方法。

7. TRPV1阻断通过HSF1调节TGFβ介导的PDAC肿瘤模型纤维化基质

紧凑的ECM，如胶原蛋白I和纤连蛋白，构成了顽固性肿瘤（如PDAC模型）的病理屏障，通常会阻碍抗肿瘤化合物的浸润。有趣的是，HSF1作为一种重要的转录因子也被报道与TGFβ1调节相关46，后者在CAF增殖、分化和随后的ECM产生中起着至关重要的作用。为了证明TRPV1阻断可能通过抑制HSF1介导的TGFβ1上调来操纵肿瘤基质，研究人员因此首先使用免疫荧光染色研究了热疗时TRPV1阻断对PANC02肿瘤细胞中HSF1分布的影响。显然，在光照射下用IS-胶束处理的细胞中观察到细胞核中HSF1发出的绿色荧光可忽略不计，而作为对照的I-胶束在光照下显示出明显的HSF1核分布，正如高共振验证的那样。绿色和蓝色荧光的定位（图7a、b），表明在高表达TRPV1离子通道的PANC02肿瘤细胞中，TRPV1阻断在高温下抑制HSF1核转位的有效性。然后，进行免疫荧光染色以研究来自接受不同处理的小鼠的PANC02肿瘤切片中的HSP70表达。

与在光照射下用I-胶束处理的抗体相比，IS-胶束导致抗HSP70抗体的红色荧光明显下调，证实了TRPV1阻断抑制应激性HSP70上调的能力。之后，进一步利用免疫荧光染色评估照射后24小时用IS-胶束处理的小鼠的PANC02肿瘤切片的体内TGFβ1水平。明显地，与PBS组相比，ISMicelles单独对TGFβ1表达的影响可以忽略不计（图7c，d），这是由于TRPV1拮抗剂的溶酶体包埋。重要的是，与来自I-Micelles的热疗小鼠相比，IS-Micelles在曝光后导致绿色荧光明显减少，这合理地归因于SB705498的大量细胞质易位以有效阻断TRPV1。显然，TRPV1阻断在热疗下调TGFβ1表达中起重要作用。

为了进一步研究TGFβ1衰减对CAF的影响，α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和成纤维细胞活化蛋白α(FAPα)的水平作为量化CAF的两个代表性标志物，在照射后24小时使用免疫荧光染色进行评估。IS-Micelles在光照射下仅导致少量α-SMA-和FAPα-阳性成纤维细胞，如绿色荧光消失所示（图7e、f），而I-Micelles的热疗显示来自α-SMA和FAPα的明显绿色荧光。它表明TRPV1阻断通过减弱热疗时TGFβ1的表达有效地抑制了CAFs的增殖和分化。

由于肌成纤维细胞CAF是高度纤维化肿瘤基质的原因，因此进一步应用两种典型ECM蛋白（胶原蛋白I和纤连蛋白）的免疫组织化学染色来评估照射后24小时用IS-胶束处理的小鼠中ECM蛋白的沉积。因此，在光照射下用IS-胶束处理的小鼠的肿瘤切片中观察到较少的胶原蛋白I和纤连蛋白，与单独接受IS-胶束和接受光I-胶束的小鼠相比，棕色明显减少表明曝光。因此，TRPV1阻断在防止热疗时细胞外基质沉积方面起着关键作用。此外，经常用于评估肿瘤纤维化的马松三色染色(MTS)也显示，在光照下用IS-胶束处理后结缔组织增生显着减少（图7g，h）。这些结果证实了TRPV1阻断通过减弱TGFβ1水平来调节胰腺肿瘤纤维化基质的能力。

为了进一步证明阻断HSF1核转位与胰腺肿瘤中TGFβ1衰减之间的相关性，HSF1A（一种有效的HSF1激动剂）在光照射前30分钟瘤内注射到PANC02肿瘤中。显然，当与HSF1A结合时，IS-胶束处理导致HSF1在光照下重新转移到细胞核中，并导致TGFβ1表达水平与单独热疗的I-胶束相似（图7i），从而导致减少抑制成纤维细胞增殖，改善纤维化。因此，TRPV1阻断介导的HSF1核转位抑制是减轻PDAC模型中肿瘤基质的关键过程。随后，应用与血管通透性密切相关的血管内皮生长因子A(VEGF-A)的免疫荧光染色来验证IS-胶束介导的热疗调节肿瘤血管通透性的能力。与单独的PBS或IS-胶束相比，I-胶束和IS-胶束导致VEGF-A表达在光照下明显增加，证实热疗能够增强肿瘤的血管通透性。免疫检查点阻断（例如aPD-L1）作为治疗癌症的有效策略出现55-58，但在治疗高度纤维化和免疫抑制性肿瘤方面的临床结果不佳。

研究人员证明了TRPV1阻断改善aPD-L1浸润到在光照射下用IS-胶束处理的PANC02肿瘤。简而言之，在照射后24小时，Cy5标记的aPD-L1被静脉注射到携带PANC02肿瘤的小鼠体内，然后在注射aPD-L1后24小时对肿瘤切片进行免疫荧光染色（图7j，k）。显然，aPD-L1在接受IS-Micelles的小鼠肿瘤中表现出相当大的外渗和约100μmin的深度渗透，而在用PBS或I处理的小鼠中仅观察到aPD-L1在肿瘤中的浅渗透-光照射下的胶束。因此，TRPV1阻断介导的TGFβ1下调和热疗诱导的血管通透性增加协同增强了光触发热疗后大分子aPD-L1在通透性差的PDAC模型中的浸润。

图7.TRPV1阻断协同热疗可降解PANC02肿瘤的高度纤维化肿瘤基质，并通过抑制HSF1核易位介导的TGFβ1上调促进aPD-L1浸润

研究结论：TRPV1阻断通过HSF1调节调节TGFβ介导的PDAC肿瘤模型纤维化基质。

8. TRPV1阻断通过减轻免疫抑制和激活免疫反应增强针对小型PDAC模型的热免疫疗法

受aPD-L1在PANC02肿瘤中大量浸润的启发，研究人员进一步研究了aPD-L1与IS-胶束对难治性PANC02肿瘤模型的体内协同抗肿瘤功效。简而言之，将IS-胶束和I-胶束以7.5mgkg.1ICG或5.0mgkg.1SB705498的剂量静脉注射到携带PANC02肿瘤（50-75mm3）的小鼠中，然后在24小时光照5分钟注射后和随后24小时后静脉注射3.0mgkg.1aPD-L1，以及随后90天的肿瘤体积和存活率测量。8.0mgkg.1Abraxane和35.0mgkg.1GEM的组合也作为临床使用的对照进行给药。IS-Micelles/aPD-L1组合完全根除肿瘤，在光照射下没有任何复发，并且所有小鼠在90天内存活，而单独的IS-Micelles未能完全消融肿瘤，因为以防止光照下的免疫逃逸。

同时，I-Micelles/aPDL1在光照下的联合治疗也导致肿瘤消融不完全，这是由于aPD-L1的耐热性和有限浸润。相比之下，Abraxane/GEM组合仍然导致肿瘤快速生长，所有小鼠在注射后55天内死亡，表明临床标准方案的疗效非常有限。IS-胶束介导的TRPV1阻断可确保对顽固的PDAC模型产生有效的热免疫治疗效果，且不会复发。

鉴于PDAC模型的高度免疫抑制微环境通常会抑制持久的免疫反应，研究人员通过监测免疫抑制性髓源性抑制细胞的体内浸润，研究了IS-胶束/aPD-L1组合减轻PANC02肿瘤体内免疫抑制的能力使用流式细胞术检测PANC02肿瘤中的(MDSCs)和肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)61。PANC02肿瘤本身拥有高比例的MDSCs，而aPD-L1治疗仅导致MDSCs频率略有下降，因为aPD-L1无法进入PDAC模型。重要的是，IS-Micelles/aPD-L1组合导致PANC02肿瘤中MDSCs频率明显降低，这也优于单独的IS-Micelles或I-Micelles/aPD-L1组合在光照下的效果。

此外，由于免疫抑制细胞因子TGFβ1的抑制，单独的IS-Micelles与光照下的I-Micelles相比也表现出明显的MDSCs频率降低，这可以促进免疫抑制细胞的增殖。因此，TRPV1阻断通过肿瘤中的aPD-L1浸润和TGFβ1调节在抑制MDSCs中发挥重要作用。同时，PANC02肿瘤被发现含有大量CD11b+F4/80+CD206+TAM（M2样特征），而与IS-Micelles相比，IS-Micelles/aPD-L1组合导致PANC02肿瘤中的巨噬细胞在光照射下从M2样TAM更有效地复极化为CD11b+F4/80+CD80+TAM（M1样特征）单独或I-胶束/aPD-L1组合，无论光照射如何，表明巨噬细胞从促肿瘤表型转变为抗肿瘤表型。相反，Abraxane/GEM组合未能有效地将巨噬细胞重新极化为抗肿瘤表型。因此，IS-胶束介导的TRPV1阻断有效地减轻了体内免疫抑制，解释了针对PDAC模型的协同热免疫疗法。

为了进一步探索IS-无胶束协同aPD-L1的免疫反应，研究人员首先评估了肿瘤引流淋巴结中树突状细胞(DC)的成熟，这是抗原特异性T淋巴细胞启动和扩增的先决条件。ISMicelles/aPD-L1组合导致小鼠淋巴结中显着的DCs成熟（CD11c+CD80+CD86+DCs）在光照下，也优于单独的IS-Micelles或I-Micelles/aPDL1组合。然后，研究人员使用流式细胞仪进一步监测肿瘤浸润的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。IS-胶束/aPD-L1组合导致肿瘤中CTL（CD45+CD3+CD8+T细胞）在光照下的频率明显提高，与单独的IS-胶束或I-胶束/aPD-L1组合分别在光照射下。显然，TRPV1阻断协同热免疫疗法可诱导CTL的启动、扩增和浸润，从而激活T细胞免疫。

另一方面，还使用流式细胞术分析对肿瘤浸润性自然杀伤(NK)细胞进行了量化。与单独的IS-胶束相比，光照射后的IS-胶束/aPD-L1组合导致NK细胞明显增加，而不管光暴露或I-胶束/aPD-L1组合，即使在光照射下，表明由于TRPV1阻断介导的ECM调节、热疗介导的温热疗法和aPD-L1介导的免疫疗法的协同作用，IS-胶束/aPD-L1组合也会引起先天免疫激活。因此，TRPV1阻断协同热免疫疗法通过PDAC模型中攻击肿瘤的免疫细胞的浸润有效触发免疫反应。

研究人员进一步证明了TRPV1阻断协同热免疫疗法是否会引起长期记忆效应以防止肿瘤复发。简而言之，携带PANC02肿瘤的小鼠最初在光照射下用IS-Micelles/aPD-L1组合治疗，然后在给药后60天为没有任何复发的存活小鼠进一步接种PANC02肿瘤细胞，随后通过在接下来的45天内测量肿瘤体积。IS-胶束/aPD-L1组合导致对小鼠肿瘤生长的完全抑制，显示出明显的长期记忆效应，而幼稚小鼠的肿瘤生长仍然具有侵袭性。为了揭示这种长期记忆效应的机制，研究人员评估了给药后60天小鼠脾脏中记忆T细胞的频率，它负责抵抗肿瘤复发。与裸小鼠相比，IS-胶束/aPD-L1组合导致CD44highCD62Llow效应记忆T细胞在光照下增加约2.2倍，从而证实了长期免疫记忆效应来自TRPV1阻断协同热免疫疗法。

TRPV1阻断通过调节肿瘤微环境增强对大型和原位PDAC模型的热免疫治疗为了进一步评估对大型PANC02胰腺肿瘤模型的协同抗肿瘤作用，该模型通常具有高度严重的纤维化和免疫抑制，研究人员建立了体积为250的大型PANC02肿瘤模型–300mm3。与其在4T1肿瘤模型和小PANC02肿瘤模型中的渗透以及在大PANC02肿瘤中的适度分布相比，ISMicelles在具有较少血管和纤维化基质的大PANC02肿瘤中的渗透相对受损。这表明IS-胶束甚至能够渗透到相对较大和纤维化的肿瘤中，确保随后TRPV1阻断与热疗的体内协同作用。如图8b、c所示，接受临床标准方案（Abraxane/GEM组合）的小鼠表现出快速肿瘤生长，所有小鼠均在治疗后38天死亡。IS-胶束通过TRPV1阻断协同热疗显着延迟了照射后的肿瘤生长。更重要的是，IS-胶束/aPD-L1组合明显增强了抗肿瘤功效，在照射后7只小鼠中有3只实现了肿瘤根除，这表明选择性抑制应激性HSP70和调节TGFβ通路共同促成了更好的治疗效果.同时，作为对照的I-胶束/aPD-L1组合显示出降低的抗肿瘤功效，这合理地归因于致密ECM导致的耐热性和aPD-L1浸润不足（图8b，c）。然后，应用流式细胞术研究荷载大PANC02肿瘤的小鼠接受不同治疗后的体内免疫反应。由于有效调节TGFβ通路11，光照下的IS-胶束导致免疫抑制性MDSC明显下调，M2样TAM明显复极化为M1样TAM，aPD-L1组合进一步提高了缓解免疫抑制的效率由于ECM降解介导的aPD-L1浸润（图8d-g）。此外，在光照下，接受IS-胶束/aPD-L1组合的小鼠也显示出明显的DC成熟，肿瘤浸润CTL的明显改善和NK细胞，优于其他对照组（图8h-j）。这些结果证明了TRPV1阻断协同热免疫疗法能够引发强烈的免疫反应，从而解释了对大型胰腺肿瘤模型的更好治疗效果。

受皮下PANC02胰腺肿瘤模型中免疫抑制的有效缓解和抗肿瘤免疫反应的强烈激活的启发，研究人员进一步探索了TRPV1阻断协同热免疫疗法对高侵袭性原位PANC02-Luc胰腺肿瘤模型的效力（图9a）。如图9b-d所示，接受aPD-L1治疗的小鼠表现出侵袭性肿瘤生长，而IS-Micelles/aPD-L1组合在光照射下有效抑制了原位PANC02-Luc肿瘤的生长，仅少数研究表明生物发光信号和明显延长的存活期，优于IS-胶束或I-胶束/aPD-L1组合。这些结果表明TRPV1阻断剂通过抑制HSP70和TGFβ自卫途径增强热免疫疗法对原位PDAC模型的有效性。

随后，进一步应用流式细胞术研究接受不同治疗方案的小鼠的体内免疫反应。与皮下PANC02肿瘤模型相比，在原位PANC02-Luc肿瘤模型中发现了更高数量的免疫抑制性MDSC和M2样TAM。单独的aPD-L1对免疫抑制性MDSC和M2样TAM的频率影响可忽略不计，而IS-胶束/aPD-L1在光照下导致免疫抑制性MDSC减少2.2倍，M1样TAM增加5.7倍与M2样TAM的比率，这比在光照下用I-胶束/aPD-L1或ISM胶束处理的小鼠更有效（图9e，f）。显然，TRPV1阻断协同热免疫疗法通过TGFβ自卫通路调节和相当大的aPD-L1浸润有效缓解了严重的免疫抑制。此外，aPD-L1本身对DC成熟的影响可以忽略不计，而与接受IMicelles/aPD-L1的小鼠相比，IS-Micelles/aPD-L1在光照下导致DC成熟增加1.6倍和1.5倍或IS-Micelles分别在光照下（图9g），从而解释了CTL的启动和随后的浸润以杀死肿瘤细胞（图9h）。此外，光照下的IS-胶束/aPD-L1也导致NK细胞浸润最高（图9i），证实了TRPV1阻断协同热免疫疗法激活先天免疫的能力。

图8.使用ISMicelles/aPD-L1组合，TRPV1阻断增强了针对皮下PANC02胰腺肿瘤的热免疫治疗功效和免疫反应

图9.使用ISMicelles/aPD-L1组合，TRPV1阻断增强了针对原位PANC02-Luc胰腺肿瘤的热免疫治疗功效和免疫反应

研究结论：这些结果进一步验证了TRPV1阻断协同热免疫疗法通过重新训练HSP70和TGFβ自卫途径激活强大的抗肿瘤免疫的能力，最终产生针对原位PDAC的更好的抗肿瘤效力。

结论与讨论

研究人员开发了纳米颗粒介导的TRPV1阻断作为调节HSF1核转位的高效方法，它选择性地抑制肿瘤中的HSP和TGFβ自卫通路，以实现针对高度恶性肿瘤（如难治性胰腺癌）的有效热免疫疗法。研究人员构建了TRPV1-KD肿瘤模型阐明TRPV1阻断能够抑制Ca2+流入和随后的HSF1核易位，从而抑制热疗时压力过表达的HSP70，从而通过减轻热阻增强癌症热疗。为了实现TRPV1阻断和热疗的有效协同作用，探索了聚合IS-胶束作为基于纳米粒子的载体，以实现肿瘤靶向同步递送TRPV1拮抗剂和热疗剂，用于肿瘤选择性TRPV1阻断协同热疗。这些ISM胶束对原发性、转移性和复发性TNBC、各种TRPV1阳性恶性人类肿瘤（包括HepG2、MDA-MB-231和PANC1肿瘤）以及小型、大型和原位HCT-116肿瘤模型显示出明显的热疗功效。同时，由于能够通过从正常表达的HSP中有效识别压力过表达的HSP来避免脱靶毒性，因此这种TRPV1阻断剂比传统的HSP70抑制剂具有更高的安全性。

特别是，研究人员进一步认识到TRPV1阻断介导的HSF1核转位抑制能够抑制TGFβ通路，促进肿瘤间质的有效分解，从而改善抗肿瘤药物（例如aPD-L1）和免疫细胞（例如CTL和NK细胞）转化为肿瘤（图8k）。因此，IS-Micelles/aPD-L1组合产生了TRPV1阻断协同热免疫疗法，通过重振免疫反应和缓解免疫抑制，有效抑制高度难治性皮下和原位PDAC肿瘤模型的肿瘤进展。研究人员认为，TRPV1阻断代表了一种有效的方法来消除肿瘤的自我防御，以增强针对各种高度恶性肿瘤的热免疫疗法，并为离子通道阻断提供了一种有效的癌症治疗方法。