从今天开始，介绍单链DNA病毒。今天介绍的病毒是腺相关病毒(Adeno Associated Virus/AAV/Adeno Associated Dependoparvovirus)，她是在20世纪60年代被发现的。与20世纪60年代比腺相关病毒更早被发现的细小病毒——鼠细小病毒(Minute virus of mice/MVM/Rodent protoparvovirus 1)一样，都是细小病毒研究的热点。

简介

        腺相关病毒(AAV)是感染人类和其他灵长类动物的小型病毒(直径20nm)。它们属于细小病毒家族的依赖病毒(Dependoparvovirus)，是复制缺陷的无包膜病毒。

        目前尚不知道AAV会引起疾病，病毒仅引起非常轻微的免疫反应。几个特殊能力使AAV成为创建用于基因治疗的病毒载体和创建同基因人类疾病模型的有吸引力的候选者。使用AAV的基因治疗载体可以感染分裂细胞和静止细胞，并以染色体外状态持续存在而不整合到宿主细胞的基因组中，尽管在天然病毒中确实发生了病毒携带的基因整合到宿主基因组中的现象。整合对于某些应用程序可能很重要，但也可能会带来不良后果。最近使用AAV进行视网膜基因治疗的人类临床试验显示出了希望。

历史

        腺相关病毒(AAV)以前被认为是腺病毒制剂中的一种污染物，在匹兹堡的Bob Atchison和NIH的Wallace Rowe的实验室中，最初被确认为细小病毒。随后对人体进行的血清学研究表明，尽管AAV自身存在于被诸如腺病毒或疱疹病毒等辅助病毒感染的人中，但它本身并未引起任何疾病。

基因治疗

优点与缺点

        由于许多功能，野生型AAV已引起基因治疗研究人员的极大兴趣。 其中最主要的是病毒明显缺乏致病性。 它也可以感染未分裂的细胞，并具有在人类19号染色体的特定位点(称为AAVS1)稳定整合到宿主细胞基因组中的能力。此功能使其比逆转录病毒更具可预测性，逆转录病毒具有随机插入和诱变的危险，有时还会引起癌症。 AAV基因组最常整合到上述位点，而随机整合进基因组的频率可以忽略不计。 然而，作为基因治疗载体的AAV的开发通过从载体DNA中去除rep和cap消除了这种整合能力。 所需基因与驱动基因转录的启动子一起插入反向末端重复序列(ITR)之间，该序列有助于单链载体DNA被宿主细胞DNA聚合酶复合物转化为双链后，在细胞核中形成串联体。 脱氧核糖核酸。基于AAV的基因治疗载体在宿主细胞核中形成游离型串联体。在非分裂细胞中，这些级联体在宿主细胞的细胞周期内保持完整。 在分裂细胞中，AAV DNA通过细胞分裂而丢失，因为游离DNA不随宿主细胞DNA复制。AAV DNA随机整合到宿主基因组中是可以检测到的，但发生频率很低。AAVs的免疫原性也很低，似乎只限于中和抗体的产生，而它们却没有引起明确的细胞毒性反应。此功能以及感染静止细胞的能力，将其作为人类基因治疗的载体，胜过腺病毒。

        使用腺相关病毒确实存在一些缺点。载体的克隆能力相对有限，大多数治疗性基因需要完全替代病毒的4.8kb基因组。 因此，大基因不适合用于标准AAV载体。当前正在探索选择方案来克服有限的编码能力。两个基因组的AAV ITR可以退火形成头对尾的串联体，几乎使载体的容量增加了一倍，剪接位点的插入允许从转录本中除去ITR。

        由于AAV在基因治疗方面的优势，研究人员创建了AAV的一种变体，称为自互补腺伴随病毒(scAAV)。  AAV包装一条DNA单链，必须等待其第二条链合成，而scAAV包装两条彼此互补的较短链。通过避免第二链合成，scAAV可以更快地表达，尽管scAAV只能编码已经有限的AAV容量的一半。最近的报道表明，scAAV载体比腺病毒载体更具免疫原性，可诱导更强的细胞毒性T淋巴细胞活化。

        由野生型感染引起的体液免疫被认为是非常普遍的事件。 相关的中和活性限制了某些应用中最常用的血清型AAV-2的用途。 因此，目前正在进行的大多数临床试验都涉及将AAV-2递送到大脑中，这是一个具有相对免疫功能的器官。 在大脑中，AAV-2具有强烈的神经元特异嗜性。

临床实验

        迄今为止，AAV载体已在全球超过117个临床试验中使用，约占病毒载体基因治疗试验的5.6％。最近，从1期和2期试验中获得了许多疾病的令人鼓舞的结果，包括莱伯先天性黑病，血友病，充血性心力衰竭，脊髓性肌萎缩， 脂蛋白脂肪酶缺乏症和帕金森氏病。

结构

        AAV基因组由正链或负链的单链脱氧核糖核酸(ssDNA)构建，长约4.7千碱基。 基因组包括在DNA链两端的反向末端重复序列(ITR)，以及两个开放阅读框(ORF)：rep和cap。 前者由编码AAV生命周期所需的Rep蛋白的四个重叠基因组成，后者包含衣壳蛋白的重叠核苷酸序列：VP1，VP2和VP3，它们相互相互作用形成二十面体对称的衣壳。

         反向末端重复(ITR)序列各包含145个碱基。 它们之所以如此命名，是因为它们的对称性，这被证明是有效扩增AAV基因组所必需的。这些赋予它们这种特性的序列的特征是它们形成发夹的能力，这有助于所谓的自引发，该自引发使第二条DNA链不依赖于酶进行合成。ITR是将AAV DNA整合进宿主细胞基因组(人类19号染色体)并从中拯救的必要条件，以及将AAV DNA进行有效的衣壳化和结合完全组装的抗DNA水解酶的AAV颗粒的制备。

       关于基因治疗，ITR似乎是顺式治疗基因唯一需要的序列：结构蛋白(cap)和包装蛋白(rep)可以反式提供。 在这种假设下，建立了许多有效生产含有报告基因或治疗基因的重组AAV(rAAV)载体的方法。 但是，也有报道称，ITR不是顺式有效复制和衣壳化所需的唯一元素。 一些研究小组已经在rep基因的编码序列内鉴定出一个称为顺式作用Rep依赖元件(CARE)的序列。当在顺式中存在时，CARE显示出增加复制和衣壳化的作用。

        在基因组的“左侧”有两个称为p5和p19的启动子，从中可以产生两个重叠的长度不同的mRNA。 这些中的每一个都包含一个内含子，该内含子可以被剪接或不被剪接。 考虑到这些可能性，可以合成四个不同的mRNA，从而合成四个具有重叠序列的Rep蛋白。 它们的名称以千道尔顿(kDa)表示它们的大小：Rep78，Rep68，Rep52和Rep40。Rep78和68可以以自吸方式特异性结合由ITR形成的发夹，并在发夹内的特定区域(指定为末端分辨位点)处裂解。 还显示它们对于AAVS基因组的AAVS1特异性整合是必需的。 显示所有四个Rep蛋白都结合ATP并具有解旋酶活性。还显示它们上调了来自p40启动子的转录，但是会下调p5和p19启动子转录。

         基因组的右侧编码三个衣壳蛋白VP1，VP2和VP3的重叠序列，它们从一个启动子p40开始。 这些蛋白质的分子量分别为87、72和62kDa。AAV衣壳由VP1，VP2和VP3的混合物组成，总共60种以二十面体对称形式以1：1：10的比例排列的单体，估计大小为3.9 MDa。 科学家们后来确定了VP3蛋白的晶体结构。

        cap基因会产生另一种非结构蛋白，称为组装激活蛋白(AAP)。这种蛋白质是由ORF2产生的，对于衣壳组装过程至关重要。迄今为止，该蛋白质在组装过程中的确切功能及其结构尚未得到解决。

        所有三个VP均由一种mRNA翻译而成。 合成此mRNA后，可以用两种不同的方式进行剪接：可以切除更长或更短的内含子，从而形成两个mRNA池：一个2.3 kb和一个2.6 kb长的mRNA池。 通常，特别是在腺病毒存在的情况下，优选较长的内含子，因此2.3kb长的mRNA代表所谓的“主要剪接”。 以这种形式，切除了从其开始合成VP1蛋白的第一个AUG密码子，导致VP1蛋白合成的总体水平降低。 保留在主要剪接物中的第一个AUG密码子是VP3蛋白的起始密码子。 但是，在同一开放阅读框中该密码子的上游是一个ACG序列(编码苏氨酸)，该序列被最佳的Kozak元件包围，这导致VP2蛋白的合成水平降低。实际上，VP2蛋白是具有额外N末端残基的VP3蛋白；VP1蛋白是具有额外N末端残基的VP2蛋白。

        由于优选剪接较大的内含子，并且由于在主要剪接中ACG密码子的翻译起始信号弱得多，所以体内合成AAV结构蛋白的比例约为1：1：10，这与成熟病毒粒子相同。VP1蛋白N末端的独特片段显示具有磷脂酶A2(PLA2)活性，这可能是晚期内体释放AAV颗粒所必需的。Muralidhar等人报告说，VP2和VP3对于正确的病毒粒子装配至关重要。然而，最近沃灵顿等人表明VP2对于完整的病毒颗粒形成和有效的感染力是不必要的，并且还提出VP2可以耐受其N末端的大插入，而VP1则不能，这可能是由于PLA2域的存在。

腺相关病毒的DNA复制过程

      腺相关病毒DNA复制为滚叉复制(Rolling hairpin Replication)。

      腺相关病毒基因组是具有末端发夹结构的单链DNA。感染后，3'发夹用作宿主修复酶的引物，将病毒的ssDNA转化为用于转录和复制的dsDNA形式。

       复制在细胞周期的S阶段处于活动状态。它由称为rep或NS1的病毒核酸内切酶起始，在发夹和编码序列之间形成缺口。这将产生一个3'端，以引发链置换复制并开始滚动发夹复制，并产生等量的ssDNA+和ssDNA-。

病毒分类

       2013年，国际病毒分类委员会认可了两种AAV：腺相关病毒血清型A(AAV-1、AAV-2、AAV-3和AAV-4)和腺相关病毒血清型B(AAV-5)。 

       直到1990年代，几乎所有AAV生物学都使用AAV-2进行了研究。但是，AAV在人类和其他灵长类动物中非常流行，并且已经从各种组织样本中分离出了几种血清型。 在人类细胞中发现了AAV-2、AAV-3、AAV-5和AAV-6，在非人类灵长类动物样本中发现了AAV-1、AAV-4、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10和AAV-11。截至2006年，已经描述了11种AAV血清型。AAV衣壳蛋白包含12个高变表面区域，大多数变异发生在三重近端峰中，但是细小病毒基因组通常在不同血清型之间呈现高度保守的复制和结构基因。所有已知的血清型都可以感染多种不同组织类型的细胞。 组织特异性由衣壳血清型决定，改变其嗜性范围的AAV载体假型化可能对它们在治疗中的应用很重要。

腺相关病毒2型

       迄今为止，AAV-2受到了最广泛的应用。AAV-2对骨骼肌，神经元，血管平滑肌细胞和肝细胞具有天然的嗜性。

       已经发现了AAV-2的三种细胞受体：硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)，αVβ5整联蛋白和成纤维细胞生长因子受体1(FGFR-1)。前者起主要受体的作用，而后两者具有共受体活性，并使AAV通过受体介导的内吞作用进入细胞。邱汉达等对这些研究结果提出了质疑。HSPG充当主要受体，尽管其在细胞外基质中的丰度可以清除AAV颗粒

其他类型

        尽管在各种基于AAV的研究中AAV-2是最流行的血清型，但已显示其他血清型作为基因传递载体可能更有效。例如，AAV-6在感染气道上皮细胞方面表现更好，AAV-7表现出非常高的鼠骨骼肌细胞转导率(类似于AAV-1和AAV-5)，AAV-8在转导肝细胞方面表现出色以及AAV-1和-5在将基因传递到血管内皮细胞方面非常有效。在大脑中，大多数AAV血清型显示神经元嗜性，而AAV-5也转导星形胶质细胞。AAV-1和AAV-2的混合体AAV-6的免疫原性也低于AAV-2。

        血清型在结合它们的受体方面可以不同。 例如，AAV-4和AAV-5的转导可以被可溶性唾液酸(每种血清型不同的形式)抑制，AAV-5被证明通过血小板衍生的生长因子受体进入细胞。

人造病毒

        为了临床和研究目的，已经进行了许多努力来设计和改进新的AAV变体。 此类修饰包括靶向特定组织的新向性和修饰的表面残留物，以逃避免疫系统的检测。 除了选择针对特定细胞的重组AAV(rAAV)特定菌株外，研究人员还探索了AAV假型化方法，即创建某些AAV菌株杂种以逼近更精细目标的实践。 通过从一个菌株中提取衣壳，并从另一菌株中提取基因组来产生杂种。例如，涉及AAV-2/5(与AAV-2的基因组和AAV-5的衣壳混合的杂交)的研究比AAV-2能够实现非杂化，能够在脑细胞中实现更高的准确性和范围。 研究人员通过创建带有混合衣壳的菌株，继续进行假型试验。AAV-DJ具有来自八种不同AAV菌株的混合衣壳；因此，它可以感染人体许多区域的不同细胞，这是单向性有限的AAV毒株所不具备的。设计和改进新的AAV变体的其他工作涉及祖先重建病毒变体，以产生具有增强特性的新载体，用于临床应用和AAV生物学研究。

免疫学研究

       由于AAV在人体中诱导免疫反应的能力明显有限，因此AAV在基因治疗师中特别受关注，AAV是一种应积极影响载体转导效率同时降低任何免疫相关病理风险的因素。

       人们认为AAV在疾病中没有任何已知作用。

先天

       在动物模型中已经表征了对AAV载体的先天免疫应答。 小鼠静脉内给药可引起促炎性细胞因子的瞬时产生，以及嗜中性粒细胞和其他白细胞向肝脏的某些浸润，这似乎可以隔离大部分注射的病毒颗粒。溶源性因子水平和细胞浸润似乎都在六个小时内恢复到基线。 相比之下，更具攻击性的病毒会产生持续24小时或更长时间的固有反应。

体液

        已知该病毒会在动物模型和人群中激发强大的体液免疫力，据认为高达80％的个体对AAV-2呈血清反应阳性。 已知抗体是中和的，对于基因治疗应用，它们确实会通过某些给药途径影响载体的转导效率。 除了持久的AAV特异性抗体水平外，在动物的初免-升压研究和临床试验中，B细胞的记忆力都很强。在血清反应阳性的人中，AAV-2的循环IgG抗体似乎主要由IgG1和IgG2亚类组成，几乎没有或没有IgG3或IgG4。

细胞介导

       细胞介导的对病毒和载体的反应的特性较差，直到2005年文献中才被忽略。使用基于AAV-2的载体治疗B型血友病的临床试验似乎表明，转导细胞的靶向破坏可能正在发生。结合数据显示CD8+T细胞可以在体外识别AAV衣壳的元件，似乎可能存在对AAV载体的细胞毒性T淋巴细胞反应。 细胞毒性反应将暗示CD4+辅助T细胞参与了对AAV的反应，人体研究的体外数据表明该病毒确实可能诱导此类反应，包括Th1和Th2记忆反应。在AAV衣壳蛋白VP1中已鉴定出许多刺激T细胞的抗原决定簇，如果将该病毒用作基因治疗的载体，这可能是修饰衣壳的诱人靶点。

感染循环

        从感染细胞到产生新的感染性颗粒，AAV感染周期有几个步骤：

1.附着于细胞膜

2.受体介导的内吞作用

3.内体运输

4.从晚期内体或溶酶体逃逸

5.易位至核

6.脱膜

7.AAV基因组的双链DNA复制形式的形成

8.rep基因的表达

9.基因组复制

10.cap基因的表达，后代ssDNA颗粒的合成

11.组装完整的病毒粒子

12.病毒从被感染的细胞中释放出来。

        这些步骤中的某些步骤在各种类型的细胞中可能看起来有所不同，这部分地有助于AAV的定义性和十分有限的天然向性性。 病毒的复制也可以在一种细胞类型中变化，具体取决于细胞当前的细胞周期阶段。

        腺相关病毒的特征是复制缺陷，因此无法在未受影响的细胞中繁殖。腺相关病毒通过与辅助病毒共同感染细胞而传播。被描述为能够成功产生新的AAV粒子的第一个辅助病毒是腺病毒，这也就是腺相关病毒名字的由来。然后表明，可以通过选自腺病毒基因组的选定蛋白，其他病毒(例如疱疹病毒、痘苗病毒或乳头瘤病毒)或遗传毒剂(例如紫外线辐射或羟基脲)来促进AAV复制。根据是否存在辅助病毒，AAV的生命周期分别遵循裂解途径或溶源途径。如果存在辅助病毒，则AAV的基因表达会被激活，从而使病毒可以使用宿主细胞的聚合酶进行复制。当辅助病毒杀死宿主细胞时，将释放新的AAV病毒体。如果不存在辅助病毒，则AAV表现为溶源性行为。当AAV单独感染细胞时，其基因表达被抑制(AAV不复制)，其基因组被整合到宿主基因组中(进入人类19号染色体)。

        在极少数情况下，AAV可在没有辅助病毒的情况下自行复制，但通常AAV无法自行复制和杀死细胞。

       Matsushita与Ellinger等人发现了有效生成子代AAV颗粒所需的最小腺病毒基因集。 该发现允许重组AAV的新生产方法，其不需要腺病毒共感染AAV生产细胞。在没有辅助病毒或遗传毒性因子的情况下，AAV DNA可以整合到宿主基因组中或以游离形式存在。 在前一种情况下，整合是由Rep78和Rep68蛋白介导的，并且需要在整合区域两侧存在ITR。在小鼠中，已观察到AAV基因组以游离形式(环状首尾构象)在静态组织(例如骨骼肌)中长期存在。

       下期要介绍的病毒是第一个与人类疾病有关的细小病毒——细小病毒B19，敬请期待！