大肠杆菌表达系统简介

1. 代谢途径和基因表达调控机制比较清楚

 1) 全基因组测序，共有4405个开放性阅读框架；

 2) 基因克隆表达系统成熟完善；

 3) 繁殖迅速，培养简单，操作方便，遗传稳定。

2. 培养周期短

 1) 大肠杆菌繁殖能力强，在营养条件充足时，20~30mins即可繁殖一代；

 2) 大规模发酵成本低，具有巨大的生存潜力。

3. 目标基因表达水平高

　表达水平较一般真核表达系统高，某些外源基因在大肠杆菌中的表达量可达总蛋白的5%~30%。

4. 遗传背景清楚

 1) 对大肠杆菌的遗传背景和生理特性研究相当清楚，已有多种不同的抗药性、不同营养缺陷型和不同校正突变型的菌株供选择使用；

 2) 可以根据不同的载体而选择不同的菌株。

5. 抗污染能力强，下游工艺简单，易于控制。

6. 已有大量可供选择利用的表达载体，被美国FDA批准为安全的基因工程受体菌。

艾柏森生物大肠杆菌表达系统优势

1. 艾柏森生物大肠杆菌可溶性表达成功率高达95%；

2. 艾柏森生物可以提供多种大肠杆菌表达载体，pET28b、pET22b、pGEX-6P-1等。

3. 多种大肠杆菌表达宿主，标准表达菌株BL21，可增强表达蛋白的菌株T7E，表达毒性蛋白的C41，增强蛋白可溶性表达的超低温菌株Arctic，以及其他经过艾柏森生物分子技术团队改造过的表达菌株，可以满足客户的不同需求。

4. 表达系统的优化。通过对表达系统进行优化，很大程度上解决蛋白不表达和包涵体的问题，如表达载体与表达菌株相容性测试、诱导表达条件的优化、复性等。

服务组合

服务项目 (Service Items)周期（周） Time(weeks)蛋白分析与密码子优化项目开始前完成基因合成2~4载体构建1基因表达纯化测试21L发酵表达及纯化2切标签2大规模的发酵与纯化以项目需要为准总计8~10

注：

1）表达纯化测试一般包括2种载体，3种表达菌株，2个表达温度，12个条件的测试，根据客户的前期实验结果，有可能调整或缩短试验周期；

2）我们可提供的备选优化条件如下：

表达载体pET28b\pET32a\pGEX-6p-1\pET22b\pBAD\pTrcHis等表达菌株Arctic\BL21(DE3)\Origami\Rosetta\T7 Expresss表达温度16℃\30℃\37℃

经典案例

以某原核蛋白为例:

1. 优化表达体系，包括苏朱军、诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度及培养基。

宿主菌诱导温度诱导时间诱导剂培养基T7E，BL21,C41,Arctic30℃/37℃1h/4hIPTG自诱导LB/定制/同位素/自诱导

经过3轮优化，我们选择了BL21+pGEX-6p-1组合，并发现温度对与目标蛋白的表达影响最大，如图一

图一:融合蛋白小试SDS-PAGE分析图

M:ProteinMarker；：诱导前总蛋白；

2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀。

2. 在确定了最优表达条件后，我们对蛋白进行了GST琼脂糖亲和层析尝试纯化，如图二，

      

图二：GST琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE分析图

M：Protein marker；S：上样；F：流出；1：20mM GSH洗脱组分；

3. 在确定纯化效率可以接受的条件下，我们对蛋白进行了大体积发酵，并最终纯化SDS-PAGE分析，如图三，融合蛋白经过纯化，SDS-PAGE电泳分析在相应位置出现明显条带，表明目的蛋白成功得到了纯化。

 

图三：蛋白最终纯化SDS-PAGE分析图

M：Protein marker；1：目的蛋白

4. 蛋白浓度测定

采用SK3071 非干扰型蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度为1.06mg/mL，待测样品体积为10μL，结果如下：

测试1测试2平均值BSA（μg）0.9390.9390.93900.8750.8740.874580.8080.8040.806160.740.7460.743240.6180.6160.617400.8550.8490.852500.8910.8780.8845目的蛋白

图四：蛋白浓度测定