项目文章丨尿路上皮癌的单细胞测序揭示巨噬细胞和CD8+T细胞在疾病进展和免疫治疗反应

2022年11月，中国科学院北京基因组研究所慈维敏团队和北京大学第一医院李学松、周利群团队合作在 Theranostics（IF=11.6）上发表了关于尿路上皮癌的研究论文。研究人员对从 12 名上尿路尿路上皮癌（UTUC）患者处获得的 13 个手术肿瘤组织进行了单细胞转录组测序，深入解析了 UTUC 的肿瘤生态系统，在 UTUC 上发现了和膀胱尿路上皮癌（UCB）中相似的预后相关亚型，阐明了其肿瘤微环境差异，并利用模拟免疫逃逸的计算方法预测了 IMvigor210 免疫治疗队列患者治疗反应，进一步为 UC 患者的免疫治疗提供潜在的治疗靶点。

该研究基于 10x Genomics 平台的单细胞测序技术服务由博奥晶典提供。

研究背景
尿路上皮癌（UC）是最常见的泌尿系统肿瘤之一，膀胱尿路上皮癌（UCB）的发病率大约占 UCs 的 90-95%，而上尿路尿路上皮癌（UTUC）仅占 UCs 的 5-10%，但其恶性程度显著高于 UCB。免疫检查点抑制剂（ICI）能够影响局部晚期或转移性 UC（mUC）的治疗。与 UCB 相比，UTUC 对 ICI 的反应率更高，识别可能有益于 ICI 治疗的患者仍然是临床上主要的挑战之一。

技术路线

主要结果

1、UTUC 的单细胞转录组图谱

为了表征肿瘤内异质性，研究人员从 12 名 UTUC 患者处收集了 13 个手术组织样本（包括 12 个原发性肿瘤和一个配对的肿瘤血栓）用于单细胞转录组测序。经聚类注释，共获得 9 种主要的细胞类型，包括 T 细胞、髓系细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肥大细胞、B 细胞、浆细胞和自然杀伤（NK）细胞（图1B-E）。作者发现肌层浸润性（MI）肿瘤中的免疫细胞富集程度更高，而上皮细胞的比例明显低于非肌层浸润性（NMI）肿瘤（图1F），在大队列的 bulk 测序数据中，作者同样观察到类似结果（图1G）。表明肿瘤细胞和免疫环境之间的串扰可能在塑造肌肉侵袭性方面发挥作用。

2、MI UTUC 中的管腔和基底亚型

为了更好地理解癌细胞中可能与免疫细胞共同发挥作用的细胞程序，作者基于拷贝数变异（inferCNV）分析鉴定出 31,152 个恶性细胞，并利用一个包含 47 个基因的 BASE47 panel 将恶性细胞分为管腔和基底亚型（图2A，B），同时构建了管腔和基底亚型评分系统，发现基底亚型评分与较低的疾病生存率（DSS）相关，而管腔亚型评分与高 DSS 相关（图2C）。差异基因分析识别了管腔和基底亚型间的 521 个差异基因（图2D，E），GO 富集分析结果表明管腔亚型与上皮发育相关，基底亚型与免疫调节相关（图2F)。进一步分析结果显示与管腔亚型相比，基底亚型的髓样趋化特征和免疫逃逸基因表达上调，从而富集了参与调节髓样细胞分化的基因（图2G），同时基底亚型比管腔亚型具有更强的免疫逃逸表型。

3、基底亚型中富集免疫抑制巨噬细胞群，与较差的临床预后相关

作者进一步对髓系细胞进行了亚群分析。巨噬细胞为髓系中主导的细胞类型并被分为 4 个亚群（图3A-C），其中亚群 Macro-C3 显著富集于基底亚型中（图3D），并表达 CD8+T 细胞招募相关基因和免疫检查点及逃逸基因 (图3B)，同时表现出诱导免疫耐受基因的表达上调（图3E）。基于 Macro-C3 的标记基因，作者开发了 Macro-C3 特征评分（图3F），用于临床意义的评估。对日本 UTUC 队列数据中特征的评估结果显示，基底亚型的 Macro-C3 特征得分显著高于 NMI 和管腔亚型（图3G），同时较高的 Macro-C3 特征得分与 DSS 和无进展生存率（PFS）的降低显著相关（图3H）。表明基底 UTUC 中巨噬细胞的免疫抑制作用增强。

4、基底亚型中的耗竭 T 细胞的扩张

T/NK 细胞被进一步分为 8 个亚群，包含 1 个 Naïve T、2 个 CD4+ T、3 个 CD8+ T 及 2 个 NK 亚群（图4A-C）。作者发现基底型中 naïve T 细胞的相对比例显著低于 NMI 和管腔型（图4D），而耗竭型 CD8+ T 细胞表现出明显的富集（图4E），提示基底型肿瘤微环境中 CD8+ T 细胞功能障碍和免疫耗竭增加。TCGA-BLCA 和日本 UTUC 队列数据集的解卷积分析结果显示，耗竭 CD8+ T 细胞的升高与 UCB 和 UTUC 患者的不良生存率显著相关（图4F）。表明基底型 UTUC 中的免疫监视减弱。

5、髓系和淋系间的相互作用形成了基底型 UTUC 的免疫抑制微环境

鉴于基底亚型中恶性细胞、巨噬细胞和 T 细胞共有免疫抑制表型，作者推测不同的细胞群间参与复杂的串扰。细胞互作分析结果显示在髓系细胞中，巨噬细胞与上皮细胞间具有最广泛的交流，并通过 MIF 和 CD74 介导信号传导（图5A，B）。进一步分析发现，CD8+ T 细胞丰度及巨噬细胞来源的 CXCL 表达之间存在显著的正相关关系（图5C），同时 CXCL 及其受体介导了基底亚型中巨噬细胞及 CD8+ T 细胞间的强烈互作（图5B）。多色免疫荧光染色显示基底亚型中巨噬细胞和 CD8+ T 细胞的共定位（图5D），表明巨噬细胞可能在 CD8+ T 细胞向 UTUC 的募集中发挥重要作用。作者接下来探讨了募集的 CD8+ T 细胞耗竭的机制，发现免疫抑制巨噬细胞通过广泛的受配体对作用驱动 CD8+ T 细胞的耗竭，日本 UTUC 队列数据进一步验证了这种关联（图5E-H）。表明 UTUC 中髓系和淋巴细胞之间存在着强烈的相互作用，同时上皮细胞、巨噬细胞和 T 淋巴细胞间合作塑造基底亚型中的免疫抑制微环境及耗竭 T 淋巴细胞的浸润（图5I）。

6、Macro-C3 评分预测 mUC 的免疫治疗反应

为了评估对免疫治疗的反应和耐药的决定因素，作者使用 IMvigor210 免疫治疗队列来研究 mUC 中阻断 PD-L1 的临床活性。相较于管腔亚型及 NMI，基底亚型显示出更明显的炎症表型（图6A，B）。免疫细胞中 PD-L1 的表达和 Macro-C3 评分与 NMI 和管腔亚型的应答相关，但与基底亚型无关（图6C）。巨噬细胞和 CD8+ T 细胞间互作分析表明这两种细胞间存在多种显著的免疫抑制相互作用导致了基底亚型的免疫逃逸（图6D）。此外，免疫抑制的 Macro-C3 标志基因和 T 细胞毒性基因的表达随着基底亚型标记的增强而增加（图6E）。由此，作者开发了使用 Macro-C3 评分和 T 细胞毒性评分来模拟免疫逃逸程度的计算方法，预测了基底评分较低的 mUC 患者接受 PD-L1 抑制剂治疗的反应（图6F-H）。

研究结论

研究利用单细胞转录组测序揭示了 UTUC 中存在和 UCB 中相似的预后相关的基底和管腔亚型，基底亚型中富集免疫抑制的巨噬细胞和耗竭型的 CD8+ T 细胞，并且 CD8+ T 细胞、巨噬细胞和肿瘤来源的上皮细胞之间的串扰形成了基底亚型免疫抑制微环境。通过整合 IMvigor210 免疫治疗队列，研究团队开发了一种模拟免疫逃逸的计算方法，预测了基底评分较低的 mUC 患者接受 PD-L1 抑制剂治疗的治疗反应。研究结果为提高 UC 患者抗肿瘤免疫提供新的治疗靶点，为不同 UC 亚型提供新的预后及治疗反应评估策略提供理论基础。

参考文献

Liang Y, Tan Y, Guan B, et al. Single-cell atlases link macrophages and CD8+ T-cell subpopulations to disease progression and immunotherapy response in urothelial carcinoma. Theranostics. 2022;12(18):7745-7759. doi:10.7150/thno.77281.