实验干货 | 病毒包装滴数低？试试这样解决
利用病毒载体是一种高效的将外源遗传信息递送入靶细胞的方法。
制备重组病毒载体通常需要在大肠杆菌中扩增携带目的基因的质粒DNA，然后将这些质粒DNA转染包装细胞。重组病毒从这些包装细胞中产生，然后经过分离纯化、浓缩等步骤获得病毒原液。
然而，这些复杂的实验步骤无疑增加了实验的难度，病毒包装实验常常会因为载体设计、转染步骤，以及转基因毒性等步骤发生问题而导致失败。
在这里我们总结了一些经验，相信可以帮助大家在进行病毒包装时尽可能获得高滴度的病毒。
01 滴度检测差异
从包装细胞分离出病毒后，为确保高效地转导靶细胞，检测病毒滴度以确定病毒产量成为一个不可或缺的步骤。检测病毒滴度有很多种方法，而使用哪一种方法则需要根据实际情景综合考虑。
值得注意的是，选择正确的滴度测定方式，要根据病毒类型和特性来进行判定，需在物理滴度（病毒数量）与功能滴度（生物学功能水平）之间作出抉择，或者二者兼而有之。
对于不同种类的病毒，不同类型的病毒可使用不同的方法检测，下面是常见的几种病毒的滴度测定方法。
每种滴度检测方法都有其优缺点，使用哪一种方法与可利用的实验资源有关。滴度检测结果产生差异也是很常见的现象，这是因为不同的方法、模型、试剂以及设备均有可能带来不同的测定结果。此外，病毒降解后也会导致滴度降低。
02 检查载体问题
病毒包装滴度低的情况可能源自上游多个实验步骤的问题。针对此类情况，首先要确保载体设计是正确的。比如，当克隆至载体的转基因超出了载体骨架推荐的容量限制，又或者包含一段横跨数百或者更多碱基的高GC含量（>70% GC%）序列，都会降低病毒滴度。
对于AAV载体来说，其反向末端重复序列（ITR）是一种GC富集序列。当ITR发生序列错误会直接影响其复制，进而影响病毒滴度。确保ITR的完整性对于获得高滴度的AAV病毒包装具有重要作用。
另外，大家还要确保自己使用了合适的包装辅助质粒和包装细胞。比如，二代慢病毒的转移质粒载体不可被用于三代慢病毒包装体系。其次，包装细胞必须可以被转移质粒和其它辅助质粒有效转染。当细胞表现出衰老化时，会降低转染效率，从而最终导致病毒包装滴度变低。
病毒的最后收集步骤也是重要的一步：需要保证在合适的时间点和条件下收集病毒（考虑收集上清、细胞沉淀、以及两者均收集）。
03 毒性基因
在排除以上因素后，如果病毒滴度仍然偏低，建议考虑载体携带的转基因的毒性影响。实际上，目前已知有相当一部分基因是对包装细胞具有毒性的，比如凋亡类型的基因Bax、GSDME，细胞周期调节因子类型的基因BABAM2、NEK1，以及与细胞增殖调控相关的基因FRL1、Foxn1。
多项研究表明，当这些基因被克隆到转移载体并转染到相应的包装细胞时，由于细胞毒性的影响，病毒包装实验可能无法获得高滴度的病毒（McClean et al., 2009 & Janus et al., 2020）。
另外，一些与CRISPRa系统相关的基因（如p65/HSF1基因）也被发现可能减少病毒产量。
如果不得不使用具有毒性的基因，一个最直接的改善方式是更换使用强度更弱的启动子。
下表展示了不同强度启动子条件下包装含有Foxn1基因的AAV病毒。数据表明，使用强度更弱的启动子可以增加病毒产量，使其达到了采用同等启动子的EGFP转基因的病毒包装效果。
此外，也可以运用诱导型或者组织特异性启动子让转基因在包装细胞中维持低的表达水平。如果在转移质粒中的携带强启动子是必须的，则可以通过改造包装细胞来抑制转基因在包装细胞中的活性。
对于shRNA载体，一种常用的方法是通过在包装细胞中抑制DICER的活性降低shRNA的活性。这样的方式多种多样，比如说将毒性基因分解成多个片段克隆至转移质粒，并且特别适用于在AAV中克隆大片段的转基因。该方法需要精心设计载体，一般在没有其它方法可用时才会使用。
病毒载体的优势在于可以更容易地对多种类型的细胞进行基因递送，然而对于不同的应用和靶细胞，我们想要取得足够高的病毒滴度仍然有一些挑战。
除了提及的合适的载体设计和优化转染条件，调整转移载体上的启动子类型或者包装细胞中的下游靶点则常被用于减少毒性基因的影响。
云舟生物对于病毒载体的设计的每一个关键步骤均有丰富的实践经验。下表展示了我们已发现容易导致低病毒滴度的基因类型。对于这些基因的病毒包装，建议采用特殊的或诱导型启动子。
参考文献
1. Janus P, Toma-Jonik A, Vydra N, et al. Pro-death signaling of cytoprotective heat shock factor 1: upregulation of NOXA leading to apoptosis in heat-sensitive cells. Cell Death Differ. 2020;27(7):2280-2292.2. McLean JE, Datan E, Matassov D, Zakeri ZF. Lack of Bax prevents influenza A virus-induced apoptosis and causes diminished viral replication. J Virol. 2009;83(16):8233-8246.3. Sena-Esteves M, Gao G. Titration of Lentivirus Vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2018;2018(4):10.1101/pdb.prot095695.4. Tiscornia G, Singer O, Verma IM. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 2006;1(1):241-245.5. Wang F, Cui X, Wang M, Xiao W, Xu R. A reliable and feasible qPCR strategy for titrating AAV vectors. Med Sci Monit Basic Res. 2013;19:187-193. Weaver LS, Kadan MJ. Evaluation of adenoviral vectors by flow cytometry. Methods. 2000;21(3):297-312.
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