Molecular Cell（IF 19.328）| 同济大学医学院袁健团队合作研究揭示高阶DNA修复拓扑结

2023-04-13 13:41 作者:维真生物 0人读过 | 我要投稿

当DNA双链断裂（DSB）时，哺乳动物细胞有两种主要的修复途径：同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)。BRCA1和53BP1分别是HR和NHEJ的两个关键因子，能在受损染色质上形成独特且互斥的拓扑结构域。最近的研究表明53BP1可以形成与拓扑相关结构域(TADs)高度重叠的纳米结构域(NDs)，然后成熟为更高阶的微结构域(MD)，在物理和功能上限制BRCA1。重要的是，53BP1-MD高阶结构的缺失导致BRCA1扩散，这可能导致DNA断端的过度切除和基因组不稳定。然而，53BP1如何在DSB诱导后组织成MD，以及这是否是一个积极调控的过程目前尚不清楚。

近期，同济大学医学院袁健教授团队联合美国梅奥医学中心楼振昆团队在“Molecular Cell，IF 19.328”上发表文章“SLFN5-mediated chromatin dynamics sculpt higher-order DNA repair topology”报道了SLFN5是53BP1在DSB处高阶拓扑排列的一个关键因素，SLFN5与53BP1染色质结构域结合，通过在DSB处驱动受损染色质动力学来组装更高阶染色质拓扑结构，以保障基因组的稳定性。

研究所用慢病毒干扰载体
pLent-U6-sh53BP1-CMV-copGFP-P2A-Puro
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· 部分结果展示 ·

1. SLFN5在调节53BP1依赖的DSB修复中发挥作用

53BP1在DSB修复中的功能与NHEJ、端粒融合、类别转换重组(CSR)和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制(PARPi)反应有关，SLFN5与53BP1存在相互作用，且相互作用网络扩展到其他NHEJ因子。作者分别研究了SLFN5在端粒融合，CSR和PARPi中的作用：发现SLFN5缺陷导致Trf2-KO诱导的端粒融合显著抑制，且SLFN5和53BP1在调节Trf2-KO诱导的端粒融合方面存在遗传上的互作性；Slfn5敲除阻碍了脾B淋巴细胞向IgG1、IgE、IgG2b和IgG3的类转换，表明Slfn5缺乏导致CSR受损；与53BP1一样，在BRCA1缺陷的癌症中，SLFN5的缺失通过HR的恢复赋予PARPi耐药。SLFN5对端粒融合、CSR和PARPi反应的影响，提示SLFN5在53BP1依赖的DSB修复中发挥作用。

图1. SLFN5促进端粒介导的融合

2. SLFN5在DSB位点积累并在53BP1下游发挥功能

SLFN5缺失导致HR增加，NHEJ减少，而不影响细胞周期，表明SLFN5在调节HR与NHEJ的平衡方面发挥了作用。为了研究SLFN5如何促进NHEJ，作者评估了它的定位，发现SLFN5定位于FokI（核酸酶）生成的DSB位点。为了确定SLFN5是否以53BP1依赖的方式定位到DSB，作者构建了53BP1缺失细胞，发现SLFN5向DSB位点的募集显著减少，但SLFN5的耗尽并不影响53BP1向DSB的募集，表明SLFN5向DSB位点的募集需要53BP1。SLFN5的缺失显著促进了BRCA1在DSB中的募集，当SLFN5耗尽时，BRCA1在DNA损伤部位的聚焦强度增强。考虑到SLFN5和53BP1促进NHEJ同时抑制HR, SLFN5缺失细胞中较高的BRCA1强度很可能是由于53BP1通路的缺陷。

图2 SLFN5在DSB位点积累并在53BP1下游发挥功能

3. SLFN5调节53BP1的高阶拓扑排列

作者发现SLFN5的缺失导致53BP1-MD拓扑结构的破坏，表现为异常无序的53BP1-NDs。53BP1-MDs的拓扑结构定量结果也显示，SLFN5的敲除显著增加了53BP1-MDs的平均宽度和异常分布，表明SLFN5是53BP1-MDs拓扑排列所必需的。进一步研究发现SLFN5定位于53BP1-MD跨越环型的界面和边界，重要的是SLFN5的动力学募集与53BP1相似，在DNA断裂后早期可检测到，这表明，SLFN5调控53BP1-MD组装的起始步骤。同时SLFN5缺失导致功能失调端粒上53BP1-MD的拓扑破坏，表明SLFN5在DSB和去保护端粒的53BP1-MD的高阶染色质组装中起作用。

图3 SLFN5调控53BP1的高阶染色质拓扑结构

4. SLFN5通过53BP1调节受损染色质迁移

为了研究SLFN5如何调节53BP1的功能，作者研究53BP1与SLFN5相互作用的结构域，发现损害53BP1介导的染色质迁移的突变体(DMob)和53BP1寡聚受损的突变体(DCore)，显著降低了53BP1和SLFN5之间的相互作用，表明SLFN5与53BP1的相互作用能介导DNA损伤依赖性染色质迁移和寡聚。作者验证了这一结论，发现在SLFN5缺失的细胞中，mCherryBP1-2病灶移动的距离减少，且SLFN5介导的受损染色质运动需要其与53BP1及其ATP酶活性的相互作用。同时快速蛋白液相色谱分析发现，DNA损伤后，53BP1表现出高分子量复合物的增加，SLFN5缺失使53BP1复合物的大小减小，并由大到小重新分布，表明SLFN5可能在促进53BP1寡聚中发挥作用。综上所述，SLFN5-53BP1相互作用对于53BP1介导的受损染色质迁移和53BP1寡聚至关重要。