如何制作稳定的转染细胞系

如何制作稳定的转染细胞系

转染是一种基因转移方法，其中遗传物质通过化学或非化学方法故意引入宿主细胞。有两种类型的稳定转染细胞系：

1. 稳定细胞系的主要类型是通过将转染的DNA直接整合到宿主生物体的基因组中而产生的。转染的DNA通过同源重组整合到基因组中。

2. 产生稳定细胞系的另一种方法是转染DNA的游离体维持。真核载体用于转染未整合到基因组中的DNA。然而，游离体DNA的稳定性很低。此外，附生体仅由某些类型的物种维持。稳定转染的细胞系如图1所示。

图1：稳定转染的细胞系

步骤

生成稳定细胞系所涉及的步骤如下所述。

1. 生成确定最佳选择抗生素浓度的杀伤曲线 – 细胞承受越来越多的抗生素浓度，以确定在一周内杀死所有细胞所需的最低抗生素浓度。

2. 转染具有所需质粒构建体的细胞 – 转染方法因宿主细胞类型而异。脂质体试剂用于贴壁细胞系的转染。电转染或病毒方法用于转染悬浮细胞系。

3. 选择和扩增稳定的多克隆菌落 – 在转染 48-72 小时时，将高浓度、最佳浓度和低浓度的选择性抗生素添加到培养物中，以获得稳定转染的细胞系。

如何在细胞系中选择转染的DNA

选择标记与转染的DNA共表达，用于选择成功转染的细胞。标记基因可能位于用于转染宿主细胞的同一载体（顺式）中，也可能位于另一个载体（反式）中。对抗生素的耐药性，如新霉素，沸蛋白，潮霉素，嘌呤霉素，DHFR等可用于选择。此外，转染的基因可以用GFP标记。

结论

稳定的细胞系主要可以通过将转染的DNA整合到基因组中来制造。此外，转染DNA的游离体维持也可用于在某些宿主生物中长时间制造稳定的细胞系。应该有一种选择方法用于鉴定细胞系中转染的DNA。