细胞培养、细胞传代、细胞冻存实验技巧

细胞培养：

模拟体内的生理环境，在无菌、适宜温度和一定的营养条件下，使离体细胞生存、生长并维持结构和功能的一门技术。包括细胞传代、换液、冻存、复苏几个操作。

细胞传代：

体内细胞生长在动态平衡环境中，培养细胞的生存环境是平皿等容器，生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程成为传代。

贴壁细胞：

试剂：PBS、胰酶、含血清培养基

流程：

1.观察：显微镜观察培养细胞的生长状态是否良好、细胞密度是否达到了80%-90%

2.废弃液：倒掉细胞瓶里的培养液

3.清洗：用PBS清洗1-2次

4.消化：加入适量的胰酶进行消化，在显微镜下观察到大部分细胞收缩变圆，即可弃去胰酶（目的是切掉细胞与瓶壁、细胞与细胞间的黏连）

5.吹打：加入适宜含血清培养基，并用滴管按顺序轻柔吹打，混匀细胞。（加培养基终止胰酶作用）

6.传代比例：根据细胞的具体生长情况，取合适的培养液继续培养。（加入传代比例1:4，可以理解为细胞瓶里有4ml的细胞悬液，取了1ml到新的培养瓶进行培养）

7.补充含血清培养基，做好标记，放入孵箱培养

100%细胞密度：

80%细胞密度

70%细胞密度

40%细胞密度

细胞换液：

通过换液清除掉细胞在生长过程中产生的代谢废物，补充新鲜的含血清培养基，使细胞能够正常生长。

试剂：PBS、含血清培养基

流程：

1.弃液：弃去细胞瓶中的培养液

2.清洗：用PBS清洗1-2次

3.加液：添加新鲜的含血清培养基

4.培养：放入孵箱培养

细胞冻存：

将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存。

试剂：冻存液、PBS、胰酶、含血清培养基

（冻存液：即含有DMSO二甲基亚砜和血清的溶液，DMSO的作用是放置在低温零度以下至-196℃保存细胞时，细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤。 血清 的作用是为细胞提高营养。DMSO和血清互溶时会散发热量，所以冻存液需要提前制备）

冻存液的配方不是固定的。

①血清：DMSO=9:1

②含血清培养基（血清浓度为10%-20%）：DMSO=9:1

③含血清培养基（血清浓度为10%-20%）：血清：DMSO=7:2:1

流程：

1.观察：对数生长期细胞

2.废弃液：倒掉细胞瓶里的培养液

3.清洗：用PBS清洗1-2次

4.消化：加入适量的胰酶进行消化，在显微镜下观察到大部分细胞收缩变圆，即可弃去胰酶（目的是切掉细胞与瓶壁、细胞与细胞间的黏连）

5.吹打：加入适宜含血清培养基，并用滴管按顺序轻柔吹打，混匀细胞，制成细胞悬液

6.离心：1000r/min离心5min弃上清液

7.冻存：加入冻存液，轻轻吹吸均匀，按每管1ml的量，装入冻存管，4℃冰箱内20min，转入20℃冰箱30min，-80℃过夜，最后放入液氮罐中（不是直接将冻存管放进去）

两种冻存方法：

①传统冻存法：先放入4℃冰箱内20min，之后转入-20℃冰箱30min，再-80℃冰箱过夜，最后放入液氮罐中保存。

②程序降温冻存法：将冻存管转移至细胞渐冻盒后放于-80℃冰箱过夜，再转移至液氮长期保存。

细胞复苏：

将冻存在液氮中的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程。

试剂：含血清培养基

流程：

1.从液氮中取出冻存管，迅速置于37℃水浴中1min（不超过3min，解冻时，边晃动边观察，当看到只有一小块冰存在时，即可从水浴锅中取出）

2.打开冻存管，迅速将细胞悬液吸到离心管中，轻轻混匀、

3.1000r/min离心5min，弃去上清液

4.沉淀中加入适当培养液，放入孵箱中培养。（复苏的细胞需要在24h后换一次培养液）