去泛素化酶USP6通过调节NMDA受体的稳定性影响记忆和突触可塑性

写在前面

        今天推荐的是由厦门大学神经科学研究所王鑫教授团队在2019年12月16日发表于PLOS Biology（IF：8.208，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是王鑫教授，研究发现人科动物特异性基因USP6作为一个新的NMDA受体调控因子，可通过去泛素化途径调节NMDA型谷氨酸受体的降解和稳定性，进而调控突触可塑性和学习记忆能力。

研究背景

        泛素特异性蛋白酶6是一种人类去泛素化酶，以前与智力障碍和自闭症谱系障碍有关。尽管很多研究将 USP6 与更高的大脑功能联系起来，但尚未研究USP6在认知中的潜在作用。

摘要部分

        在这里，作者报告 USP6 在诱导的人类神经元中高度表达，并且USP6的神经元特异性表达增强了转基因小鼠模型中的学习和记忆。同样，USP6 表达调节USP6转基因小鼠海马中 N-甲基-D-天冬氨酸型谷氨酸受体 (NMDAR) 依赖的LTP（长时程增强）和LTD（长时程抑制）。转基因 USP6 小鼠皮层的蛋白质组学特征揭示了 NMDAR 泛素化减弱，伴随 USP6 过表达的 NMDAR 表达、稳定性和细胞表面分布的升高。USP6 正向调节转染细胞中的 GluN1 表达，USP6 下调阻碍突触后密度的局灶性 GluN1 分布，并损害源自人类胚胎干细胞的神经元的突触功能。总之，这些结果表明USP6 增强了 NMDAR 稳定性以促进突触功能和认知。

研究内容

1.USP6增强了USP6转基因小鼠的学习和记忆行为 

        以前的研究表明，USP6在多种人体组织中都有表达，而在睾丸中的表达量最高。利用定量反转录PCR（qRT-PCR）分析，作者发现，USP6mRNA水平在分化的兴奋性神经元和中间神经元中很高，而在ESC和星形胶质细胞中可检测到一些表达。 

        为了研究与USP6在小鼠大脑中获得功能有关的潜在影响，作者在CamK2a启动子（CAM-USP6）的调控下产生了一个表达C端血凝素（HA）标记的人USP6的转基因小鼠模型。者观察到转基因USP6在大脑皮层和海马中的表达，而在小脑中则无法检测到它的表达。

        鉴于USP6是一个同源的特异性基因，而且研究指出破坏USP6基因的表达与智力低下有关，USP6可能在人类的高级认知功能中起作用。为了验证这一假设，作者用NOR测试评估了CAM-USP6动物和它们的WT同胞的学习和记忆，观察到CAM-USP6转基因动物与WT对照组相比具有更高的识别指数，且在莫里斯水迷宫任务中的空间参考记忆和反转学习中表现更佳。

研究结论：作者构建了人USP6的转基因小鼠模型，研究发现USP6的过度表达增强了CAM-USP6小鼠的空间记忆和认知灵活性。

2.USP6增强了体内的社会互动和超声波发声频率 

        USP6位点的异常遗传中断也与社会行为障碍有关。为了确定转基因USP6的表达是否能影响小鼠的社会行为，作者进行了三室试验，发现在社会性测试试验中，与空笼子相比，CAM-USP6小鼠花更多时间接近 "陌生 "小鼠。

        作者通过超声波发声（USV）记录进一步描述了CAM-USP6幼鼠的交流行为。隔离诱导的幼崽USV行为是一种广泛用于描述人类疾病的小鼠模型的方法，这些疾病涉及语言和社会行为的缺陷。CAM-USP6幼崽在出生后第7天比WT对照组更频繁地发声，表明转基因USP6的表达可以增强幼崽和母鼠之间的交流。

研究结论：USP6的上调能增强空间记忆行为以及语言和社会互动的各个方面。

3.USP6的表达并不影响USP6转基因小鼠的皮质发育     

        以前曾观察到USP6的类似物TBC1D3的表达通过增加神经祖细胞的产生而在大脑发育过程中诱发皮质折叠。为了研究USP6在胚胎神经发育中的潜在作用，作者利用Nestin启动子（Nestin-USP6）产生了表达USP6的转基因小鼠，并与野生型小鼠的大脑皮层在各个方面进行比较。

研究结论：与以前TBC1D3的结果相反，转基因USP6的表达并没有明显改变大脑的大体解剖结构或皮质分层/折叠，也不会影响突触密度和形态。

4.CAM-USP6小鼠显示出增强的突触功能

        作者通过电生理记录实验发现USP6的表达对基础突触传递的影响很小甚至没有。为了确定USP6的表达是否会影响CAM-USP6小鼠的突触可塑性，作者检查了CAM-USP6小鼠的NMDAR依赖的LTP和LTD反应。作者发现，与WT对照组相比，CAM-USP6的海马CA1LTP增强，LTD减弱。鉴于AMPARmEPSC记录显示正常反应，AMPAR功能似乎在CAM-USP6和WT小鼠中都是完整的。为了确定CAM-USP6小鼠NMDAR功能的潜在差异，作者测量了CAM-USP6小鼠和WT对照组的NMDA/AMPA比率和诱发的NMDA电流，作者观察到海马CAM-USP6CA1神经元的NMDA/AMPA比率和NMDA-eEPSC幅度增加。

研究结论：USP6的表达增强了CAM-USP6小鼠的NMDAR依赖性突触功能。

5.USP6通过其去泛素化活性稳定NMDARs 

        作者用生化分馏法观察到USP6在突触体和PSD富集部分的分布，表明USP6可能通过突触蛋白的去泛素化影响突触功能。因此，作者对从小鼠皮层组织中提取的胰蛋白酶消化蛋白进行免疫纯化，以获得用二甘醇Ub标记的肽，并比较这些二甘醇肽在CAM-USP6小鼠皮层组织和WT对照组中的相对丰度。使用这种方法，作者确定了175个蛋白质（150个上调，25个下调）在CAM-USP6和WT小鼠大脑中不同程度地与Ub结合。

        有趣的是，作者观察到参与突触功能和可塑性相关途径的二甘醇标记的蛋白质富集，包括WT与CAM-USP6转基因小鼠大脑中的LTP。在小RhoGTP酶Rac家族的小GTP酶1（Rac1）以及突触标记（Syt）1中观察到不同的Ub特征。作者还观察到CAM-USP6与WT的Ub特征在突触后成分中的差异，直接与PSD功能相关，包括PSD95和NMDAR亚单位GluN2B。

研究结论：CAM-USP6可能驱动突触功能的变化，以调节/增强记忆、认知和社会行为。

        接下来作者探究在CAM-USP6大脑中Ub相关蛋白质组中确定的关键目标的表达是否发生改变。通过western blot，作者观察到CAM-USP6小鼠皮层和海马中GluN1、GluN2A和GluN2BNMDAR亚基的上调，但GluA1和GluA2 AMPAR水平几乎没有差异。通过对CAM-USP6小鼠皮层的qRT-PCR分析，作者观察到谷氨酸受体mRNA表达几乎没有变化，这表明NMDAR表达的差异是由于蛋白质水平的调节。

         为了研究USP6的上调是否会影响NMDAR亚基在细胞表面的分布，作者对来自WT和CAM-USP6小鼠胚胎的初级神经元进行了细胞表面生物素标记的试验。作者观察到细胞表面GluN1的明显上调，但AMPAR亚基GluA1或转铁蛋白受体（TfR）没有变化，表明CAM-USP6在增强细胞表面NMDAR分布方面发挥了潜在作用。此外，与WT对照组相比，在CAM-USP6小鼠大脑的突触体和PSD富集馏分中观察到GluN1、GluN2A和GluN2B的水平增加，这些结果表明USP6在介导生理上的GluN1平衡和细胞表面分布方面的作用。作者随后在表达GluN1的人类HEK293T细胞系中研究了USP6敲低的影响。作者发现shRNA介导的USP6敲低明显降低了GluN1蛋白的表达，增加了泛素化GluN1的水平。

研究结论：NMDA受体是USP6的潜在底物。

6.USP6与NMDARs相互作用，减弱USP介导的NMDAR转化

        作者接下来探究USP6是否与NMDAR亚单位相互作用。从CAM-USP6小鼠脑裂解液中免疫沉淀（IP）成功地证明了USP6与NMDAR亚单位（GluN1和GluN2B）的共沉淀。作者进一步表征了NMDAR与TBC或USP域USP6同源物（即TBC1D3和USP32）的结合；作者发现USP6和TBC1D3都与GluN1/GluN2B共沉淀。

研究结论：N-末端的TBC结构域是NMDAR相互作用所必需的。

        随后，作者比较了WT和CAM-USP6小鼠皮层中GluN1的泛素化；使用GluN1抗体的GluN1 IP和随后的Ub免疫印迹分析更高分子量的聚Ub结合物，证明USP6的表达降低了体内聚泛素化GluN1的水平。此外，Ub IP和通过免疫印迹检测GluN1表明，在CAM-USP6大脑中，GluN1与Ub共沉淀减少。在GluN1-Myc转染的HEK293T中，shRNA介导的USP6敲低导致聚泛素化的GluN1积累。这些发现共同表明，USP6的下调可能会增强Ub结合的GluN1的积累。为了确定USP6是否影响GluN1的周转，作者在过量表达GluN1的HEK293T细胞中进行了环己酮追随试验；作者发现GluN1的降解被shRNA介导的USP6下调明显加速。

研究结论：USP6可以与NMDAR亚单位相互作用，并通过减少NMDAR泛素化促进其稳定。

7.剥夺USP6会降低ESC衍生的人类兴奋性神经元中NMDAR的表达和功能

        为了研究USP6在人类神经元模型系统中的影响，作者从H9 ESCs分化出人类兴奋性神经元。为了确认ESCs成功分化为兴奋性神经元，作者在成熟分化的神经元中进行了微管相关蛋白（MAP）2（树突标记）和谷氨酸转运体（vGluT）1（兴奋性神经元标记）的染色。作者还通过贴片钳记录分化的神经元对不断增加的刺激的动作电位反应来证实成熟。为了进一步确定USP6功能的丧失是否对ESC衍生的人类神经元中GluN1的表达有消极的调节作用，作者使用慢病毒在分化的神经元中转导USP6靶向的shRNA。USP6的敲除明显减少了树突状GluN1点的形成和GluN1/PSD95点的共定位。此外，shRNA介导的USP6下调减少了mEPSC频率，但对诱导的人类兴奋性神经元的mEPSC影响很小。

研究结论：USP6的下调可以减少GluN1在PSD的聚集/分布，并损害ESC衍生的人类神经元模型的mEPSC频率。

USP6 在 PSD 处去泛素化 NMDAR，从而促进 NMDAR 的稳定，进而增加 NMDAR 功能和突触活动并增强认知。

结论与讨论

        作者构建了USP6过表达小鼠模型，人类USP6在大脑皮层和海马内的兴奋性神经元中特异性表达。USP6转基因小鼠在莫里斯水迷宫(MWM)和新物体识别(NOR)测试中表现出增强的学习和记忆行为。此外，转基因USP6表达增加了小鼠大脑中的突触功能和NMDAR表达。与USP6功能获得的认知增强一致，人胚胎干细胞(ESC)衍生神经元中shRNA介导的USP6敲减降低了NMDAR的表达和功能。作者还发现USP6与NMDAR结合并使其去泛素化，从而增强NMDAR稳定性。总之，作者将USP6鉴定为NMDAR的新型特异性调节剂, USP6通过翻译后稳态机制增强NMDAR稳定性，其调节可以影响突触活动和记忆形成。

Thank you!

原文链接：https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000525