USP15通过去泛素化和TET2失活抑制肿瘤免疫

写在前面

        今天推荐的是由美国北卡罗来纳大学Lineberger综合癌症中心在2020年9月18日发表于ScienceAdvances（2020IF：14.136，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Yan-pingXu教授，研究表明USP15通过去泛素化和TET2失活抑制肿瘤免疫。

研究背景

        TET2 DNA二氧酶在人类造血性恶性肿瘤中经常发生突变，并在许多实体瘤中通过非突变机制实现功能失活。

摘要部分

        先前的研究表明TET2介导干扰素JAK-STAT通路以刺激淋巴细胞(TIL)的趋化因子表达和肿瘤浸润。TET2在K1299处被单泛素化，从而促进其活性。在这里，作者报道Usp15是一种TET2去泛素化酶和抑制剂。Usp15催化去除K1299连接的单泛素并负调节TET2活性。基因表达谱表明TET2和Usp15反向调节参与多种炎症通路的基因，TET2是Usp15功能的主要目标。黑色素瘤中Usp15的缺失以TET2依赖性方式刺激趋化因子表达和TIL，导致对免疫治疗的反应增加并延长荷瘤小鼠的寿命。这些结果揭示了以前未知的TET2活性调节剂，并表明Usp15作为实体瘤免疫治疗的潜在治疗靶点。

研究内容

1.USP15与TET2结合       

        为了鉴定TET2的DUB，作者建立了稳定表达FLAG-TET2的293T细胞，然后异位表达WT DCAF1。作为对照，作者异位表达了突变的R1247A/R1283A DCAF1，该点突破坏了其泛素化TET2的能力。作者进行免疫沉淀(IP)并结合进行质谱分析，以鉴定TET2相互作用蛋白。作者鉴定了大量TET2相互作用蛋白，其中有一种DUB，即Usp15。

        为了证实TET2与Usp15的相互作用，通过IP-Western印迹分析，作者发现在Flag-TET2免疫复合物中很容易检测到异位表达的Myc-USP15。使用识别TET2或Usp15的抗体，作者在人类U2OS细胞和小鼠B16-卵白蛋白(OVA)细胞中通过IP-Western测定检测了Usp15和TET2之间的内源性相互作用。接下来，作者将Usp15结合位点映射到TET2的C端CD结构域。使用纯化重组蛋白的体外下拉分析证明了人类Usp15和人类TET2蛋白的CD结构域之间的直接相互作用。

研究结论：Usp15和TET2在物理上相互作用，TET2的CD域负责它们的关联。

2.USP15在K1299处去泛素化TET2

    为了确定Usp15是否催化TET2去泛素化，作者首先异位表达WT或催化失活突变体C269A Usp15与Flag-TET2并进行体内泛素化测定。WT Usp15的过表达，而不是催化失活的突变体，降低了TET2的单泛素化。接下来，作者将WT或催化失活的Usp15转染到稳定表达HA-泛素的U2OS细胞中，然后对内源性TET2进行IP-Western分析。该实验表明，当Usp15过表达时，内源性TET2的单泛素化显着降低。相反，293T和U2OS细胞中Usp15的敲低显着增加了异位表达和内源性TET2的单泛素化。为了确定Usp15是否在K1299（先前证明的TET2泛素化位点）处特异性去泛素化TET2，作者用Usp15转染带有Flag标签的WT或K1299N突变体TET2，然后进行体内泛素化测定。Usp15的过表达不能进一步降低K1299单泛素化水平，表明Usp15在K1299处特异性去泛素化TET2。相反，作者证明Usp15的敲低会增加WT TET2的泛素化，但不会增加K1299N突变体TET2的泛素化。在Usp15–KO和Usp15/Tet2 DKO B16-OVA细胞中，作者发现Usp15的缺失显着增加了K1212（人类中的K1299）Tet2的单泛素化。

研究结论：USP15在K1299处去泛素化TET2。

3.USP15使TET2失活并抑制TET2与底物DNA的结合     

        为了确定Usp15-TET2相互作用的功能意义，作者首先进行了斑点杂交实验，以确定异位表达Usp15的细胞中的5hmC水平。作者发现WT的过表达，而不是C269A催化失活突变体Usp15，使TET活性降低了67%。用siRNA敲低Usp15使5hmC水平分别增加了41%和74%。虽然敲除B16-OVA细胞中的TET2使5hmC水平显着降低了75%，但Usp15的缺失以TET2依赖性方式使5hmC水平增加了63%。接下来，作者使用更定量的比色测定来确定基因组中的5hmC，并获得了相同的结果。       

        此外，定量荧光激活细胞分选(FACS)分析还表明，Usp15的KO增加了表达TET2的B16-OVA细胞中的TET活性。这些结果表明Usp15负调节细胞中的TET2活性。接下来，作者检查了Usp15是否影响TET2与其底物DNA的结合。结果表明，TET2与WT的共表达，降低了TET2 DNA结合。相反，沉默Usp15增强了TET2 DNA结合，表明Usp15在体外削弱了TET2与DNA的结合。

        此外，作者从WT或Usp15 KO小鼠中分离了肝脏和骨髓，并通过抗体依赖性比色法测定了5hmC水平。作者发现Usp15的KO增加了肝脏和骨髓中的TET活性。总之，这些结果表明Usp15在体内抑制TET与DNA的结合和TET活性。

研究结论：USP15使TET2失活并抑制TET2与底物DNA的结合。

4.Usp15和TET2反向调节参与多种炎症过程的基因

        作者接下来探究Usp15是否可以改变TET2靶基因的表达。作者之前报道了TET2在介导IFN-γ信号传导中的功能。因此，作者确定了用IFN-γ处理与否的WT、Tet2和Usp15 KOB16黑色素瘤细胞中的基因表达。在IFN-γ处理后，总共有1197个基因被诱导高表达。在这1197个基因中，33%被TET2KO下调，加强了TET2在介导IFN信号传导中的作用。另一方面， 45%被Usp15 KO进一步上调，证明Usp15在IFN信号传导中的重要作用。值得注意的是，181个IFN-γ诱导基因受到Usp15和TET2KO的反向调控。这些结果表明Usp15是TET2的主要抑制剂，Tet2是Usp15调节IFN-γ信号传导的主要靶点。KEGG对这181个基因信号通路分析显示，它们富含多种炎症信号通路，包括肿瘤坏死因子(TNF)、趋化因子、Toll样受体和Janus激酶(JAK)信号转导和转录激活因子(STAT)信号通路。Cxcl9、Cxcl10和Cxcl11也被TET2KO下调，但它们的表达在B16细胞中被Usp15 KO上调。

研究结论：Usp15和TET2反向调节参与多种炎症信号通路的基因的表达。

5.Usp15的缺失促进IFN-γ诱导的趋化因子表达       

        为了证实Usp15负向调节IFN-γ诱导的趋化因子表达，作者用IFN-γ处理不同基因型的B16-OVA细胞并检查转录和启动子甲基化。作者发现Usp15的缺失显着增加了TH1型趋化因子基因Cxcl9、Cxcl10和Cxcl11的mRNA水平，并且当TET2缺失时，这些增加显着减少，表明Usp15通过TET2介导对这些基因的抑制。     

        作者通过ELISA分析，Usp15的缺失以Tet2依赖的方式增加了Cxcl9和Cxcl10对IFN-γ处理的蛋白水平。然后作者进行了Transwell测定，作者发现，与在WT B16-OVA衍生的条件培养基(CM)中观察到的相比，CD8+T细胞向来自IFN-γ处理的Usp15 KO培养物的CM的迁移加速。当CM来源于经IFN-γ处理的Usp15/Tet2DKO细胞培养物时，这种增加的T细胞迁移在很大程度上被消除，表明Usp15在调节T细胞迁移对TET2上的功能依赖性。此外，将重组鼠CxcL10添加到来自TET2-KO和TET2/Usp15-DKO细胞培养物的CM恢复了T细胞迁移。这些结果表明Usp15缺失增加了IFN-γ诱导的TET2趋化因子产生，这直接导致CD8+T细胞迁移增加。

        此外，作者发现WT TET2的异位表达，而不是K1299N突变体，在很大程度上恢复了IFN-γ对Cxcl9、Cxcl10和Cxcl11的诱导。这些结果表明，USP15介导的TET2的K1299去泛素化对于IFN-γ诱导的趋化因子表达很重要。接下来，作者进行了ChIP-qPCR分析，以确定Usp15是否影响TET2与Cxcl10启动子的结合。作者证实IFN-γ刺激了TET2与B16-OVA细胞中Cxcl10启动子的结合，并发现Usp15的缺失增加了TET2与Cxcl10启动子的结合。在IFN-γ处理后，Tet2-WTB16-OVA细胞中Cxcl10启动子的5hmC水平增加了17倍，并且Usp15的缺失进一步使Cxcl10启动子处的5hmC增加了29倍。TET2的缺失几乎完全消除了Usp15敲低对刺激5hmC的影响。

研究结论：这些结果表明Usp15缺失增加了TET2与趋化因子基因启动子的结合，导致趋化因子基因的去甲基化和表达增加。

6.Usp15的缺失可以增强肿瘤浸润淋巴细胞和抗肿瘤免疫治疗

        Usp15对TET活性的负调节使作者想探究Usp15的缺失是否可以增强抗肿瘤免疫和免疫治疗效果。与亲本WTB16-OVA细胞相比，Tet2-KOB16-OVA细胞显示出相似的增殖率，并且Usp15 KO增加了细胞增殖，但这种增加与TET2无关。接下来，作者将等量的WT、Tet2-KO、Usp15-KO或TET2/Usp15 DKO B16-OVA黑色素瘤细胞皮下移植到小鼠中，然后静脉注射识别OVA抗原（在B16-OVA细胞）的OT-I细胞。Tet2的缺失显着将移植了WTB16-OVA细胞的小鼠的平均寿命从28天减少到20天。相比之下，Usp15的缺失显着将移植了WTB16-OVA细胞的小鼠的平均寿命从28天延长至35天以上。接下来，作者确定了Usp15缺失对抗PD-L1免疫疗法的影响。移植Usp15-KOB16-OVA细胞的小鼠的平均寿命比移植WT细胞的小鼠显着延长。与移植了TET2-KO细胞（20.5天）的小鼠相比，移植了TET2/Usp15 DKO细胞（24.5天）的小鼠的平均寿命也增加了16.3%，但Usp15缺失赋予了寿命的延长在TET2存在下更明显。另一方面，Usp15缺失导致肿瘤浸润CD8+和CD3+T细胞的增加，并且它们的增加取决于两种模型中TET2的表达。最后，作者检查了肿瘤内趋化因子的表达，发现虽然Cxcl9、Cxcl10和Cxcl11表达在TET2-KOB16-OVA肿瘤中显着降低，但它们在Usp15-KO肿瘤中的表达以Cxc依赖性方式增加。

研究结论：肿瘤中Usp15的缺失刺激趋化因子表达和淋巴细胞浸润，并增强抗肿瘤免疫的效果和抗PD-L1免疫疗法的疗效。

结论与讨论

        肿瘤细胞中Usp15的缺失促进了肿瘤内趋化因子的产生和T细胞的肿瘤浸润，增强了对T细胞免疫和抗PD-L1治疗的反应，从而延长了肿瘤小鼠的寿命。这些发现表明Usp15是增强实体瘤抗肿瘤免疫和免疫治疗功效的潜在治疗靶点。此外， Usp15缺陷促进T细胞活化并增强T细胞对体内肿瘤免疫的反应。作者认为开发USP15的抑制剂，可以通过增强肿瘤内在TET活性和趋化因子产生以及T细胞内在活性和IFN-y产生来特异性和有效地促进免疫治疗，并且毒性小。

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原文链接:https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abc9730