进食后，去泛素化酶USP20可以通过mTORC1-USP20-HMGCR轴诱导胆固醇生物合成

写在前面

        今天推荐的是由武汉大学高等研究院生命科学学院在2020年8月19日发表于Nature（2020IF：49.962，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Bao-Liang Song教授，研究表明进食后，USP20可以通过mTORC1-USP20-HMGCR轴诱导胆固醇生物合成。

研究背景

        胆固醇是一种必需的脂质。在哺乳动物中，胆固醇生物合成在进食后增加，并在禁食情况下被抑制。然而，对空腹-进食过渡阶段胆固醇生物合成的调控机制仍知之甚少。

摘要部分

        在这里，作者展示了去泛素化酶泛素特异性肽酶20(USP20)在进食状态下稳定HMG-CoA还原酶(HMGCR)。餐后胰岛素和葡萄糖浓度的增加刺激mTORC1在S132和S134磷酸化USP20；USP20被募集到HMGCR复合物并对抗其降解。在肝脏特异性Usp20缺失小鼠和USP20 (S132A/S134A)敲入小鼠中，喂养诱导的HMGCR稳定性被消除。USP20的基因缺失或药理学抑制显着降低饮食诱导的体重增加，降低血清和肝脏中的脂质水平，提高胰岛素敏感性并增加能量消耗。这些代谢变化被组成性稳定的HMGCR(K248R)的表达逆转。该研究揭示了通过USP20磷酸化从mTORC1到HMGCR的调节轴，并表明USP20抑制剂可用于降低胆固醇水平以治疗代谢疾病，包括高脂血症、肝脂肪变性、肥胖症和糖尿病。

研究内容

1.进食诱导HMGCR表达       

        为了研究禁食和喂养条件下胆固醇生物合成的调节机制，作者测量了肝脏中胆固醇生成酶的表达，包括HMGCR、FDFT1、羊毛甾醇合酶(LSS)和24-脱氢胆固醇还原酶(DHCR24)。禁食过夜后，小鼠被喂食高蔗糖、低脂肪、低胆固醇的饮食，以消除反馈调节的干扰。重新喂食后，HMGCR蛋白的水平增加了约20倍，而FDFT1、LSS和DHCR24的水平增加了不到1倍。编码这些蛋白质的mRNA增加了两到四倍。这些结果表明，喂食后HMGCR蛋白的诱导除了充分表征的转录调控外，还涉及转录后机制。当甾醇水平高时，HMGCR被E3连接酶gp78泛素化并靶向降解。

        当甾醇水平高时，HMGCR被E3连接酶gp78泛素化并靶向降解。作者使用体外泛素化系统评估了这种机制是否针对HMGCR降解饥饿和重新喂养的小鼠。作者观察到禁食小鼠肝细胞质中的HMGCR泛素化程度高于禁食小鼠。为了探究禁食肝细胞质中是否含有更高的去泛素化酶(DUB)活性。作者接下来进行了体外去泛素化分析。作者从用25-HC和MG132处理的CHO-7细胞中免疫沉淀泛素化HMGCR，然后将免疫沉淀物与来自肝脏的胞质溶胶一起孵育。HMGCR泛素化在禁食肝细胞溶胶存在下没有改变，但被再禁食肝细胞溶胶显着降低。总之，这些结果表明，喂养小鼠的肝脏含有更高的DUB活性，这可以保护HMGCR免受泛素介导的蛋白酶体降解。

研究结论：USP20是喂食诱导的HMGCR增加所必需的。

2.进食诱导的HMGCR需要USP20     

        作者在筛选HMGCR降解阻滞剂的筛选中将单个DUB与HMGCR和INSIG119共表达，从中筛选出USP20。与WT USP20相比，酶促失活的USP20（C154S）不能稳定HMGCR。USP20优先水解K48-和K63-键并减少HMGCR泛素化，这被USP20特异性抑制剂GSK2643943A抑制。相反，USP20的敲低加速了HMGCR的降解。

        USP20在肝脏中高度表达，表明其在肝功能中具有潜在作用。作者生成了肝脏特异性Usp20缺陷小鼠（L-Usp20-/-）。重新喂养显着增加了野生型中的HMGCR蛋白水平，但在L-Usp20-/-肝脏中没有。响应禁食-再进食转变的磷酸化AKT（p-AKT）、p-S6K、p-4E-BP1、p-ACACA、INSIG2和脂肪酸合酶（FASN）的水平在两种基因型中相似。作者接下来通过分析3H标记的H2O的掺入来测量从头胆固醇生物合成。重新喂养使野生型肝脏中的胆固醇合成增加了12.4倍，但这种影响在L-Usp20-/-肝脏中降低了45%。这些结果表明USP20是进食反应性肝脏HMGCR去泛素化酶，其消融不影响胰岛素和葡萄糖信号通路。

研究结论：进食诱导的HMGCR需要USP20参与。

3.胰岛素和葡萄糖调节USP20功能

        作者接下来试图确定介导USP20稳定HMGCR的喂养信号。由于喂食后最显着的变化发生在循环葡萄糖和胰岛素中，作者将野生型小鼠禁食过夜并腹腔内注射葡萄糖或胰岛素。肝脏HMGCR表达被葡萄糖和胰岛素协同升高，而USP20水平保持不变。胰岛素和葡萄糖在野生型中显着增加了HMGCR蛋白水平，但在Usp20缺陷型肝细胞中没有增加。胰岛素信号级联涉及PI3K、AKT和mTOR23，而AMPK在低葡萄糖时抑制mTORC1活性。PI3K抑制剂、AKTi-1/2（一种AKT抑制剂）和雷帕霉素（一种mTORC1抑制剂）都消除了USP20介导的HMGCR积累。相反，AMPK抑制剂dorsomorphin在低葡萄糖条件下通过USP20恢复了HMGCR稳定性，而AMPK激活剂A-769662在高葡萄糖条件下抑制了USP20介导的HMGCR稳定性。因此，USP20可能对mTORC1下游的胰岛素和葡萄糖有反应。

研究结论：胰岛素和葡萄糖调节USP20功能。

4.mTORC1在S132和S134位点磷酸化USP20

        定量质谱鉴定了USP20的几种差异磷酸化肽。Ser132和Ser134残基的磷酸化仅在高葡萄糖条件下检测到。作者使用了对USP20 (p-USP20)的磷酸化Ser132和Ser134特异的抗体，并表明USP20在体外被免疫沉淀的mTORC1有效特异性磷酸化。而USP20 (S132A/S134A)未被mTORC1磷酸化。雷帕霉素抑制细胞和重新喂养小鼠肝脏中USP20的磷酸化并抵消喂养诱导的HMGCR和血清脂质水平的增加。无磷酸化的USP20 (S132A/134A)和拟磷酸化的USP20 (S132D/S134D)在体外表现出与野生型USP20相似的DUB活性。然而，与野生型USP20和USP20（S132D/S134D）不同，USP20（S132A/134A）不拮抗甾醇诱导的HMGCR降解。HMGCR与野生型USP20和USP20（S132D/S134D）相互作用，但不与USP20（S132A/S134A）相互作用。这种相互作用在缺乏Gp78（也称为Amfr）的细胞中完全不存在，这表明gp78可能桥接USP20和HMGCR之间的相互作用。事实上，gp78与USP20相互作用，而不管甾醇水平如何，并且包括残基383-578在内的gp78区域是USP20结合所必需的。此外，磷酸酶处理大大减少了USP20和USP20-gp78相互作用的磷酸化。接下来，作者生成了USP20（S132A/S134A）敲入（Usp20KI/KI）小鼠。重新进食后，野生型小鼠的肝脏HMGCR水平显着增加，但Usp20KI/KI小鼠的肝脏HMGCR水平仅略有增加。USP20在S132/S134处的喂养诱导的磷酸化在Usp20KI/KI小鼠中也被消除。Usp20KI/KI小鼠的脂质水平低于野生型小鼠，肝脏基因表达谱与L-Usp20-/-小鼠相似。与来自重新喂养的野生型小鼠的肝细胞质不同，来自L-Usp20-/-、Usp20KI/KI或雷帕霉素处理的野生型小鼠的肝细胞质不会导致HMGCR泛素链的裂解。喂养诱导的胰岛素和葡萄糖信号通路激活mTORC1，其在S132和S134处磷酸化USP20。然后磷酸化的USP20结合gp78并通过去泛素化稳定HMGCR，从而增加肝脏中胆固醇的生物合成。

研究结论：mTORC1在S132和S134位点磷酸USP20。

5.L-Usp20-/-小鼠的代谢特征

        为了进一步研究USP20在代谢疾病中的功能，作者用高脂肪和高蔗糖(HFHS)饮食喂养小鼠。与WT小鼠相比，L-Usp20-/-小鼠表现出相似的累积食物摄入量和营养吸收，但体重增加较少。L-Usp20-/-小鼠表现出相似的瘦体重与体重比，但肝脏和白色脂肪组织(WAT)中的脂肪积累较少，并且所有脂蛋白组分中的胆固醇和甘油三酯水平较低。此外，L-Usp20-/-小鼠的葡萄糖清除率和胰岛素敏感性得到显着改善。Usp20KI/KI小鼠表现出类似的趋势。HFHS喂养三周后，在体重出现差异之前，L-Usp20-/-小鼠的耗氧量和能量消耗显着增加，但呼吸交换比和体力活动没有差异。事实上，L-Usp20-/-小鼠表现出比野生型小鼠更高的体温；这种增加的能量消耗为这些小鼠在维持HFHS饮食时体重增加较低和其他代谢差异提供了解释。长期HFHS饮食的小鼠会患上代谢性疾病。与食物饮食相比，慢性HFHS饮食增加了野生型和L-Usp20-/-小鼠的AKT-mTORC1信号传导并降低了AMPK活性。USP20在S132和S134处的磷酸化显着增加，HMGCR水平在野生型小鼠中升高。尽管饲料喂养和HFHS喂养的野生型小鼠对禁食-再喂养模式仍然有反应，但在HFHS喂养组中，再喂养诱导了更高的mTORC1信号传导和更高的HMGCR水平。这些结果表明，长期HFHS饮食会长期激活mTORC1，通过磷酸化USP20和加剧代谢疾病来增加HMGCR水平。

        为了研究HMGCR的不稳定是否对L-Usp20-/-小鼠的表型至关重要，作者使用腺相关病毒血清型8(AAV8)来表达HMGCR(K248R)，这是一种对甾醇诱导的降解或USP20介导的稳定具有抗性的HMGCR突变体，在小鼠肝脏中。AAV-HMGCR(K248R)表达消除了L-Usp20-/-小鼠体重、血清总胆固醇和甘油三酯的改善。L-Usp20-/-小鼠能量消耗和葡萄糖清除的增加也被HMGCR(K248R)的表达逆转。作者接下来生成了HMGCR(K248R)敲入小鼠(HmgcrKI/KI)并将它们与L-Usp20-/-杂交。与野生型HMGCR相比，HMGCR（K248R）对禁食-再喂养调节具有抵抗力，并且不受Usp20缺陷的影响。L-Usp20-/-小鼠中较低的血清脂质水平、增加的能量消耗和增加的葡萄糖清除被HMGCR（K248R）敲入逆转。

        作者接下来研究了L-Usp20-/-小鼠能量消耗增加的潜在机制。作者发现L-Usp20-/-小鼠肝脏中HMG-CoA的水平比野生型小鼠高67%。L-Usp20-/-小鼠肝脏中的乙酰乙酸酯也增加，尽管不显着，而琥珀酰辅酶A减少了约44%， L-Usp20-/-肝脏中的琥珀酸增加了1.4倍。一致地，与野生型小鼠相比，L-Usp20-/-小鼠的血清琥珀酸水平翻了一番。三羧酸循环中的其他中间体和几种已知的产热因子在L-Usp20-/-小鼠中没有显着差异，并且未检测到肝损伤。总之，这些数据表明Usp20的肝消融降低了HMGCR，后者反馈增加琥珀酸，随后刺激产热。

研究结论：长期HFHS饮食会长期激活mTORC1，通过磷酸化USP20和加剧代谢疾病来增加HMGCR水平。另一方面，Usp20的肝消融降低了HMGCR，后者反馈增加琥珀酸，随后刺激产热。

6.USP20抑制剂的作用

        USP20抑制剂GSK2643943A可用于研究USP20体内药理抑制的效果。GSK2643943A取消了重新喂养对HMGCR的诱导，同时其对磷酸化和总USP20的水平没有影响。GSK2643943A在进食状态下将胆固醇生物合成减少了约50%。一致地，GSK2643943A处理降低了血清脂质含量、改善葡萄糖清除并增加琥珀酸水平和能量消耗。作者研究了GSK2643943A是否可用于治疗饮食诱导的肥胖和肥胖相关疾病。给野生型小鼠喂食HFHS饮食15周以诱导肥胖，然后通过口服强饲法给予载体或GSK2643943A。USP20的药理学抑制不影响食物消耗或营养吸收，但通过减少脂肪量逐渐降低体重。用GSK2643943A处理后，肝脏、血清和脂肪细胞中的脂质水平显着降低。与对照小鼠相比，GSK2643943A处理的小鼠表现出更高的能量消耗和改善的葡萄糖清除率。Ucp1缺陷小鼠在GSK2643943A处理后没有表现出代谢改善，表明这些影响依赖于UCP1。此外，GSK2643943A特异性降低野生型小鼠肝脏中的HMGCR水平，与其在野生型小鼠中的作用相反，GSK2643943A处理并未改变L-Usp20-/-小鼠中的能量消耗、葡萄糖清除率或血清脂质水平。因此，GSK2643943A通过抑制肝脏USP20和HMGCR不稳定来改善代谢疾病。

研究结论：GSK2643943A通过抑制肝脏USP20和HMGCR不稳定来改善代谢疾病。

结论与讨论

        mTORC1是一种重要的营养传感器和进食后能量储存的组织者。结果显示USP20位于mTORC1的下游以促进胆固醇合成。首先，由于HMGCR蛋白水平降低, USP20活性的消耗减少了胆固醇生物合成。其次，因为内源性LXR配体不能有效产生甘油三酯和脂肪酸水平降低，从而降低SREBP1c和脂肪酸合成基因的表达。第三,USP20抑制显着增加能量消耗，至少部分是通过琥珀酸浓度的增加。证实HMGCR是USP20的主要底物，并且解释了Usp20缺乏促进的代谢改善。

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原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-020-2928-y