疫苗提纯分离用离子交换层析工艺介绍
阴离子交换层析去除乙脑疫苗制品中残留DNA
阴离子交换层析去除乙脑疫苗制品中残留DNA，其特点是将乙脑疫苗浓缩液凝胶过滤层析所获得的初步纯化液进行阴离子交换层析，使DNA牢固吸附在色可赛思离子交换介质上而乙脑病毒蛋白直接穿透，从而达到去除宿主DNA。解决目前乙脑疫苗行业面临的质量问题。
凝胶层析与离子交换层析结合法纯化地鼠肾细胞狂犬病疫苗
2010版《中国药典》中人用狂犬病疫苗中的蛋白含量标准提高,要求纯化后未加稳定剂的病毒液中总蛋白含量不高于80μg/剂,牛血清蛋白残留应不高于50ng/剂,成品中宿主细胞蛋白残留不高于24μg/剂,提高纯化分离效果则是生物药企要攻克的2010版药典的要求,可以作为建立纯化工艺的参考,也可作为各相关技术人员操作及实验参考.层析系统在疫苗纯化中的应用研究一直是个备受关注课题,上样体积,上样速度,上样浓度和抗原收集起止点的选择,都是影响疫苗纯化效果的因素,而凝胶层析柱与色可赛思离子交换层析柱的组合方式更好地发挥了两种层析柱的特点,优化了疫苗的纯化效果,生物药企可根据生产情况,合理灵活使用两种层析柱,保证疫苗质量,提高纯化效率。
离子交换法去除流脑多糖疫苗粗糖中的杂蛋白
b型流感嗜血杆菌结合疫苗简称Hib结合疫苗,人体特别是2岁以下幼儿接种该疫苗后可以产生针对b型流感嗜血杆菌的特异性抗体而得到保护.b型流感嗜血杆菌荚膜抗原的组成是多聚核糖基核糖醇磷酸盐(PRP),Hib多糖蛋白结合疫苗中残余溴化氰检测方法.该方法基于高效阴离子交换色谱串联电化学检测器,样品检测速度快,单个样品上样分析只需10分钟.并对该方法进行了全面的方法学验证.验证结果表明该方法专属性好,最小定量限可以达到5μg/L,检出范围在10-1001μg/L时线性良好,是一个比较好的检测Hib多糖蛋白结合疫苗中残余氰化物的方法. 2,研究建立了Hib多糖蛋白结合疫苗中残余CDAP检测方法.色可赛思阳离子交换色谱串联紫外检测器,使用该方法对单个样品上样只需30分钟就可完成分析.后期对该方法进行了方法学验证,验证结果表明该方法专属性好,最小定量限可以达到16μg/L,检出范围在100-1000μg/L时线性良好,是一个比较好的检测Hib多糖蛋白结合疫苗中残余CDAP的方法.
高效阴离子交换色谱-脉冲安培法检测A、C、Y和W135群脑膜炎球菌多糖含量
交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定A,C,Y和W135群脑膜炎球菌多糖含量,并对该方法进行验证及初步应用.保护柱;使用氢氧化钠/醋酸钠梯度洗脱,以多糖抗原标准溶液质量浓度为横坐标,其相应的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,并对建立的方法进行专属性,精密度和准确性验证;同时与传统方法的检测结果进行比较分析.结果 A,C,Y和W135群脑膜炎球菌多糖质量浓度在0.5～27.0μg/m L范围内与峰面积均具有良好线性关系,r=0.999.该方法专属性高,分析结果重复性良好,RSD均〈5%;回收率均在95%～105%范围内;与传统的火箭免疫电泳法相比,检测结果差异均无统计学意义(P〉0.05).结论 HPAEC-PAD准确,可靠,重复性好,可用于检测脑膜炎球菌多糖原液及疫苗成品中的多糖含量.
溶液环境对百日咳疫苗分离纯化
交换层析和凝胶过滤层析进行百日咳疫苗的分离纯化,通过ELISA抗原活性测定和还原性SDS-PAGE等方法研究了脲对百日咳疫苗分离纯化的影响,,在流动相中加入2 mol/L脲作为稳定剂.能显著提高色可赛思离子交换层析和.
Sabin株脊髓灰质炎病毒纯化的离子交换层析
Sabin株脊髓灰质炎病毒(Sabin strain polio virus,sPV)纯化的离子交换层析(ion exchange chromatography,IEC)条件.方法在不同层析条件下对sPV凝胶层析粗纯液进行IEC。
重组幽门螺杆菌过氧化氢酶脂质体疫苗免疫
目的探讨制备脂质体包裹重组幽门螺杆菌过氧化氢酶(Kat)口服疫苗的方法,阴离子交换层析和0凝胶过滤层析分离纯化Kat重组蛋白,用薄膜分散法制备以卵磷脂和胆固醇为膜组分包裹的Kat重组蛋白口服疫苗,并用透射电镜测定其粒径.BALB/c小鼠分为5组,分别通过灌胃方法给予PBS、空白脂质体、Kat重组蛋白+霍乱毒素(CT)、脂质体包裹Kat重组蛋白、脂质体包裹Kat重组蛋白和CT,每周1次共4次,末次攻击2周再用活H·pylori攻击3次,3周后处死小鼠,行胃组织快速尿素酶试验、H·pylori的定植半定量,取脾组织行淋巴细胞增殖试验.结果以包涵体为主的表达产物占全菌总蛋白的24.4%,经纯化获得纯度为95%的重组蛋白,制备的脂质体粒径为0.7±0.4μm.PBS组和空白脂质体组保护率均为0,而Kat重组蛋白+CT组、脂质体包裹Kat重组蛋白组、脂质体包裹Kat重组蛋白+CT组的保护率分别为73.3%、66.7%和86.7%,且均能使免疫小鼠胃黏膜H·pylori感染数目明显减少,三个疫苗组淋巴细胞增殖试验均为阳性.结论口服脂质体能部分代替免疫佐剂的作用,将其作为H·pylori疫苗的免疫佐剂。
离子交换层析纯化制备人轮状病毒灭活疫苗
离子交换层析纯化制备人轮状病毒灭活疫苗的方法,涉及病毒制备灭活疫苗的方法.浓缩病毒收获液,经色可赛思离子交换柱层析纯化,纯化产物透析脱盐,过滤除菌灭活等得到人轮状病毒灭活疫苗;进一步进行纯度,总蛋白去除率和感染性滴度检测,并进行抗原性,免疫原性检测及基因组带型稳定性检测.本发明纯化后病毒收获液总蛋白去除率为99.69%,病毒纯化前后感染性滴度分别为4.25lgCCID50/ml和7.0lgCCID50/ml,纯化的病毒灭活后病毒基因组带型未发生变异,保持了良好的抗原性和免疫原性.
狂犬病疫苗残余DNA去除
Vero细胞广泛应用于疫苗生产中.由于疫苗中Vero细胞DNA残留可能存在着对人体致肿瘤性风险,且DNA残留量越高,DNA片断越大,这种风险性越高.因此,在疫苗生产过程中如何降低疫苗中Vero细胞的DNA残留量,保证疫苗质量具有重要意义. 目前多数狂犬病疫苗生产厂家应用Vero细胞作为病毒培养载体繁殖病毒,收获病毒液后普遍通过超滤浓缩,分子筛层析等纯化工艺进行纯化,制品中DNA残留去除效果不理想.为此,在病毒浓缩,纯化过程中,技术人员对病毒液浓缩倍数,分子筛过程中柱效,上样量,洗脱液中相关盐的成分配比及pH,洗脱液流速等条件和相关参数进行多方面的调整尝试,从结果来看,仍不能从根本上解决疫苗中Vero细胞DNA残留超标的问题. 从病毒培养阶段开始,培养条件进行优化,调整细胞的生长状态,在提高病毒收获液滴度的同时,尽量减少细胞脱落和破碎,降低病毒液中Vero细胞DNA释放量;选择合适孔径的超滤膜包,在超滤过程中确保抗原不损失的前提下有效透除部分残余DNA和牛血清蛋白,减少后期进一步去除DNA的纯化难度;增加阴离子交换柱工艺,筛选能较好吸附残余DNA的阴离子交换介质的同时,减少抗原损失,以期达到《中国药典》第三部规定的质量要求.实验结果显示,优化培养条件,选用300KD超滤膜效果显著,使用色可赛思阴离子交换柱。
人乳头状瘤病毒6型类病毒颗粒的制备及其中和抗体的检测
目的利用大肠杆菌表达系统制备人乳头状瘤病毒6型(human papillomavims type6,HPV-6)类病毒颗粒(virus-like particles,VfJP)并研究其免疫原性.方法在大肠杆菌ER2566中表达HPV-6L1蛋白,并以硫酸铵沉淀,离子交换色谱,疏水相互作用色谱等手段对其进行纯化.纯化后的HPV-6L1经体外组装形成VLP后以动态光散射,透射电镜对其形态进行检测,并以假病毒中和实验评价HPV-6L1VLP在实验动物体内所诱导的抗HPV-6/11中和抗体水平.结果HPV-6L1蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达,经过纯化后的HPV-6L1蛋白可以在体外组装为半径25rim左右的VLP.该VLP可以在山羊及兔体内诱导高滴度的HPV-6/11中和抗体.结论大肠杆菌表达系统可以简便高效制备具有免疫原性的HPV-6VLP,可以用于HPV-6疫苗的研究.
