慢病毒/腺病毒载体感染目的细胞常见问题汇总

慢病毒载体和腺病毒载体的转导效率比常规真核表达载体高很多，因此特别适合于介导外源基因在难转染甚至无法转染的哺乳动物细胞中表达。但是在感染细胞的过程中可能也会遇到各种问题，下面我们汇总了一些实验过程中的常见问题供大家参考。

Q1：用于病毒感染的细胞接种量是多少？

根据细胞大小和增殖的速度调整细胞接种量，以保证在感染后2~3天细胞刚好快长满培养皿底部为宜。针对大部分细胞系：传代周期在2-3天，感染时细胞铺板的密度保持在30-50%左右，则细胞增殖48 h后细胞汇合度约在90%左右；针对某些原代细胞：由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到50-60%左右，但要确保在感染后2天细胞汇合度达到90-100%；针对非分裂细胞：如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照100%的汇合度进行接种。

Q2：如何确定向细胞中加入病毒的最佳时间？

慢病毒感染细胞后需要48-72 h观察到病毒携带的基因表达，腺病毒感染细胞后需要36-48 h观察到病毒携带的基因表达，应在细胞汇合度30-50%且细胞状态良好时加入病毒。

Q3：收到病毒后如何保存？

收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于4 ℃保存，并最好在一周内使用完；如需长期保存，可按需分装好放置于-80 ℃，以避免使用过程中反复冻融；如要置于液氮罐保存则需更换专门的保存管。另外，若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度。

Q4：病毒使用过程中如何进行稀释？

需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基（含血清或含双抗不影响病毒感染）混匀分装后置于 4 ℃保存（一周内使用完最佳）。以慢病毒为例：如原病毒标记的滴度为1x108 TU/mL，取10 μL至90 μL的常规培养基中，即可得到1x107 TU/mL滴度的病毒。

Q5：什么是MOI？

MOI，感染复数，是指病毒对细胞的感染能力，细胞需要的MOI值越高，证明细胞越难被感染。通常把某株细胞80%被感染时所需要的病毒颗粒数与细胞数目的比值作为该株细胞的MOI值。

相关计算公式：

每孔加病毒量（μL）=MOI × 细胞数 / 病毒滴度（TU/mL或PFU/mL）×1000

MOI=（病毒滴度 × 病毒体积）/ 细胞数

Q6：感染悬浮细胞或半悬浮细胞时，没有平角离心机怎么办？

感染悬浮或半悬浮细胞，通常需要通过平角离心转染法提高感染效率。若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清，然后加入适量的病毒液，轻轻吹打混匀5-10下，室温放置15 min（尽量不要超过30 min，间隔10 min可以再吹打一次），然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染即可。

Q7：对照病毒或目的病毒感染细胞以后，细胞形态发生改变或者细胞死亡？

首先，确定细胞或病毒是否有污染；其次，确定病毒感染MOI值是否过高，调整MOI值，并在感染后的4 h、8 h和12 h对细胞进行观察，若发现细胞状态变差时，则需要使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液；排除以上因素后细胞状态仍然不好，尝试增加血清含量，观察细胞状态是否好转。

Q8：细胞能被病毒感染，但为何GFP荧光很弱？

GFP慢病毒感染细胞后，荧光强度取决于病毒进入到细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型、观察时间、GFP前的启动子活性等因素。

GFP基因荧光表达的强度与启动子的活性、目的细胞感染的病毒颗粒数呈正相关。慢病毒在增殖较快的细胞中感染48 ~ 72 h（腺病毒则是36 ~ 48 h），GFP蛋白表达才达到峰值；在增殖较慢的细胞中，GFP蛋白表达到达峰值需更久。GFP基因由强启动子启动时荧光表达较强，弱启动子启动则荧光表达较弱。

观察荧光时最好关掉室内灯光，只留荧光显微镜光源。

Q9：为什么过表达病毒比对照的荧光要暗？

不同类型的病毒有对应的载体包装容量，基因的插入会影响位于其下游的荧光蛋白等基因的表达。对照病毒或干扰病毒，由于没有插入基因或者插入基因非常短，荧光表达通常较强，影响较小甚至没有。而插入了较长基因片段之后，荧光的亮度会随着插入基因的长度以及特殊结构的存在等而减弱，尤其是出现高GC片段，由于影响了转录，荧光强度会大大降低。

Q10：要曝光很长时间才能观察到荧光，原因是什么？

可能的原因有：

①显微镜汞灯使用时间长，可以通过对照病毒排除，若对照较亮可排除显微镜问题；

②pH值低，看培养基是否发黄，pH值较低会导致绿色荧光淬灭；

③目的病毒荧光不亮，插入目的基因后的病毒荧光强度会相较对照弱一些，属于正常现象，可加长曝光时间。

Q11：如何提高病毒对细胞的感染效率？

病毒对细胞的感染效率受多个因素影响，如病毒活性、细胞自身的状态、MOI值、感染时间等。

①病毒活性：解冻病毒一定要在冰上进行，尽量避免反复冻融。-80 ℃保存半年以上需要重新测滴度。

②目的细胞：先进行预实验测试，看病毒载体是否合适感染目的细胞。对于悬浮细胞，可采用平角离心感染的方法，减少病毒感染时的体积，从而提升感染的效率。

③MOI值：进行MOI梯度摸索实验，找出最优的MOI值。

④感染时间：太早换液会导致感染效率下降；换液太晚，则对细胞的损伤较大。若细胞状态比较好，可适当延长换液时间来进一步提高感染效率。

⑤助转剂：可根据情况添加一定浓度的polybrene，不同细胞对polybrene的敏感性不同，可以用1-10 μg/mL 的范围筛选合适浓度，以24 h内细胞无明显毒性反应为佳。

Q12：慢病毒载体和腺病毒载体，该怎么选？

不管是慢病毒载体还是腺病毒载体，都是很好的基因调控工具，各自有自己的优势，主要根据实验目的不同来选择，可以参考以下几个方面来判断：

（1）  插入目的序列的大小：慢病毒载体包装容量在2kb以内可以保证滴度，腺病毒包装容量在5kb以内可以保证滴度；若目的序列大小超过载体容量，滴度则会随着目的序列大小增加而降低；

（2） 是否需要构建稳转细胞株：慢病毒载体可以将外源基因随机整合到目的细胞基因组中并稳定遗传，即可用于构建稳转细胞株，当然做瞬时转染也可以；而腺病毒不整合基因组，只适用于瞬时转染；

（3） 目的细胞类型：像神经细胞、一些原代细胞等感染难度比较大的细胞，且后续无需建立稳转株，推荐使用腺病毒，其感染效率要远高于慢病毒。

Q13：腺病毒不够用？需要重新包毒吗？

腺病毒可以在293A细胞中进行自我复制，因此可参考腺病毒包装过程中的扩增步骤进行病毒扩增，无需重新包毒。

Q14：腺病毒可以扩增，会不会比较危险？

  我们的腺病毒载体经过了一系列的改造，病毒在293细胞系以外的细胞中并不能自我复制，且腺病毒本身不具有整合到基因组的能力，从而大大降低了其危险性。腺病毒对加热、去垢剂、医用消毒水、福尔马林等均很敏感。但UV照射无法有效灭活，所以所有接触过病毒的器皿或枪头需要84消毒液浸泡半小时后用自来水冲洗，然后丢弃或回收即可。