Nature communications | 单细胞转录组学揭示了EGFR信号介导的胃祖细胞分化在胃稳态中
2023年5月，由Hitomi Takada为第一作者，Akira Kurisaki为通讯作者，在《nature communications》发表了题为《Single-cell transcriptomics uncovers EGFR signaling-mediated gastric progenitor cell differentiation in stomach homeostasis》的文章，该文章创新性的证实了EGFR信号在正常胃稳态中发挥的是促进分化的功能，而不是有丝分裂的功能。
首先，作者探究了祖细胞向隐窝细胞分化的转录因子及调控途径，作者使用FatelD算法进行分析数据，其中一种主要细胞标记物Pgc在大多数胃上皮细胞中mRNA水平均有较高的表达，如先前报道，从成熟的隐窝细胞到胃主要细胞的表达水平逐渐增加。但有趣的是，在观察到Pgc表达的情况下，隐窝细胞、祖细胞和颈细胞呈现连续的分化状态，而壁细胞被认为是孤立的集群。
从祖细胞到隐窝细胞分化的表达谱共鉴定出47个基因共表达节点。节点的分层聚类确定了两个主要群体。从祖细胞到隐窝细胞表达增加的A组基因含有各种隐窝细胞标记物，如Gkn2、Gkn1和Mucsac，而在祖细胞中高表达的B组基因含有已知的祖细胞标记物，如Mki67、Pcna和Stmn1。隐窝细胞相关的A组除了先前报道的隐窝细胞分化相关的TF KLF431外，还含有FOXA3、PPARG、TCF23等转录因子。相比之下，祖细胞相关的B组含有DNMT1、CEBPB、FOXM1和HMGAL，它们的表达与增生性胃癌相关。
作者使用g:Profiler对A组基因进行分析，确定了与隐窝细胞分化相关的调控途径，包括整合素、EGFR和MAPK信号通路等。B组基因涉及的通路与细胞周期和增殖有关，与祖细胞的高增殖状态一致。此外，TNF-α/NF-kB信号通路和蛋白酶体降解途径在B组基因中表达。值得注意的是，EGFR信号和TNF-α/NF-kB信号分别在隐窝细胞相关组A和祖细胞相关组B中表达。（图1）
配体-受体表达谱强烈提示TGFα-EGFR信号通路参与了隐窝细胞分化。因此，作者接下来利用一个完善的胃类器官系统来研究这种信号传导对隐窝细胞分化的影响。在培养过程中发现，类器官中大约一半的细胞是MK167增殖祖细胞，其他细胞是弱表达GKN2的未成熟的隐窝前细胞。因此，随后的分析主要集中在隐窝细胞，标记Muc5ac、Gkn2和Aqp3；以及祖细胞标记Mki67的表达。此外，作者分析了Sox9和Pgc的表达，其表达水平从隐窝细胞到颈细胞逐渐增加。
在隐窝细胞分化过程中，TNF-NF-кB信号下调，提示TNF-NF-кB信号可能调控祖细胞。先前的研究报道了Iккβ/NF-кB信号在幽门螺杆菌感染诱导的细胞凋亡和坏死中起抑制作用。然而，NF-кB信号在体内的作用仍然难以捉摸。作者通过CellChat进行的配体-受体分析，发现TNFSF12-TNFRSF12a是祖细胞中主要的TNF信号驱动因子之一，我们用该配体处理胃类器官。TNFSF12处理后强烈诱导Mki67、Sox9和Pgc的表达。下调隐窝细胞标记物后，经免疫荧光染色证实，在TNFSF12处理的胃类器官中，MKI67、SOX9和NF-KB的表达增加，但GKN2蛋白的表达没有明显变化。值得注意的是，TNFSF12处理的胃类器官中，大多数SOX9t细胞为MK167高表达，提示TNFSF12在维持MKI67/SOX9前体细胞中的作用（图2）。
作者进一步探索了参与隐窝细胞分化的EGFR信号的下游效应因子。结果显示，肌动蛋白细胞骨架相关基因，包括ARP2/3复合物亚基(Aprclad Arpclb, Arpc2, Arpc3, Arpc4和Arpc5)的表达在隐窝细胞分化过程中上调。与此一致的是，ARP2/3抑制剂CK666完全阻断了细胞形态学的改变，即使在用TGFα处理后也是如此。有趣的是，CK666下调了隐窝细胞标志物的表达，上调了Mki67和Sox9的表达。这些数据表明，ARP2/ 3介导的肌动蛋白细胞骨架组织参与了隐窝细胞分化过程中的形态变化，并可能参与了基因表达。
MAPK信号通路中也富含隐窝细胞分化相关基因。为了研究MAPK通路是否是TGFα介导的隐窝细胞分化的一个下游通路，作者在TGFα存在的情况下用ERK和MEK抑制剂处理胃类器官。ERK抑制剂SCH772984完全抑制了隐窝细胞标志物的表达，恢复了Mki67和Sox9的表达。MEK抑制剂PDO325901也抑制TGFα介导的基因表达变化。免疫荧光染色证实PDO325901抑制TGFα诱导的胃类器官中ERK的磷酸化。在TGFα存在的情况下，用Stattic阻断EGFR的另一个下游组分STAT3并不影响隐窝细胞标记物的表达，这表明ERK是体外TGFα-EGFR介导的隐窝细胞分化的主要下游效应物之一（图3）。
综上文所述，这些体外和体内实验验证了计算机预测的胃上皮细胞分化的分子机制。EGFR信号通路促进祖细胞向隐窝细胞分化并随之诱导形态改变，NF-kB信号通路作为祖细胞维持的锚点。
