随着关注CRISPR/Cas9 技术的人越来越多，我们也收到了来自不同地区想尝试CRISPR/Cas9 技术的人的提问，我们将这些问题进行汇总与解答，并开通了新的邮件栏目，每周将根据不同主题挑选三个值得分享的问题，以期能帮到更多想要了解与使用CRISPR/Cas9 技术的人！

问：请问一下，利用CRISPR/Cas9技术做基因敲除的时候为什么要加同源臂？

答：首先，加入同源臂主要是用于细胞点突变实验，通过在突变位点两侧加入同源臂，让事先设计好的突变位点整合到基因序列上，实现定点突变。不过一般对微生物进行基因敲除时需要加上同源臂，以修复断裂后的基因；而对哺乳动物进行基因敲除时是不需要添加同源臂的。

问：请问CRISPR/Cas9技术怎样同时敲除两个基因，以及后续怎样筛选双阳性细胞？

答：首先，利用CRISPR/Cas9技术进行双基因敲除时一般有两种方式：

1、先构建单基因KO细胞系，再构建第二个基因的细胞系；

2、同时转两种基因的gRNA，实现双基因同时敲除。第一种方法的优点是筛选阳性率高，并且还能够获得一个单敲的细胞株，丰富实验数据，但是周期比较长；第二种的实验周期比较短，但是阳性率不高，可能会出现一直无法筛选到双阳性克隆的情况。所以我们公司在进行双基因敲除服务时都会根据客户的具体情况选择最佳的方式，以确保敲除的成功。另外我们还能对超5000个基因的敲除保证WB。

关于第二个问题，如何鉴定双阳性的方法其实和鉴定单敲的差不多，都可以选择PCR、测序或WB来进行鉴定；具体操作流程建议可以考虑先构建出Cas9稳转的细胞系，然后再分别转不同的gRNA或者同时转两种基因的双gRNA病毒。

问：利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除时怎样有效的防止脱靶现象？

答：首先CRISPR/Cas9技术的脱靶率不高，因为gRNA的打靶规则比较严格的，需要有PAM位点才能完成打靶，相比于RNAi技术来说，脱靶率是低了很多的；但事实上仍存在脱靶的可能性，所以我们在设计方案的时候，需要选择特异性分数比较高的gRNA来降低脱靶率。如果在gRNA设计过程中遇到了问题，可以尝试使用我们红棉系统的gRNA设计功能（点击立即查看使用方法）；另外也可以在筛选单克隆的时候，尽量筛选多一些阳性克隆，利用不同的克隆来排除脱靶问题的影响。