USP13控制Aurora B的稳定性影响整个细胞周期的进程

写在前面

        今天推荐的是由比利时布鲁塞尔自由大学在2020年8月8日发表于Oncogene（2020IF：9.866，JCR Q1）的一篇文章，通讯作者是Gustavo J. Gutierrez教授，研究表明USP13控制Aurora B的稳定性影响整个细胞周期的进程。

研究背景

        Aurora B激酶在有丝分裂中起重要作用。它的蛋白质水平在有丝分裂开始前增加，在有丝分裂结束时急剧下降。后者的减少是由于E3泛素连接酶后期促进复合物或环体与去泛素化酶USP35的作用之间的平衡。Aurora B还在相间执行重要功能。间期Aurora B的异常调节导致细胞周期缺陷，通常与异常的染色体浓缩和分离有关。然而，人们对Aurora B水平如何在相间进行调节知之甚少。

摘要部分

        在这里，作者发现USP13与细胞中的Aurora B相关并使其稳定，尤其是在它们进入有丝分裂之前。为了使USP13对Aurora B发挥稳定作用，Aurora B介导的USP13在丝氨酸114处的磷酸化促进了它们的结合。此外，作者报告指出SP13以非催化的方式使Aurora B去泛素化并保护它不被降解，对USP13的细胞水平/活性进行遗传或化学调控会影响细胞周期进展。总的来说，作者的研究揭示了USP13-Aurora B轴的分子和细胞联系，它可能参与了发生在癌细胞中的细胞周期的重构。

研究内容

1.Aurora B在体外和细胞使USP13中的第114位丝氨酸磷酸化

        已发现多个DUB受磷酸化调控，因此作者利用MIT-Scansite在线软件来确定使USP13磷酸化的可能磷酸化位点。发现S114 似乎嵌入了激酶Aurora B和/或 PKA 的标志性磷酸化基序中。考虑到作者之前报道过USP13控制Skp2-p27轴从而影响细胞周期，而Aurora B激酶也参与细胞的控制循环，说明两者可能存在联系。因此，作者使用全长GST-USP13和重组Aurora B进行了放射性体外激酶测定，作者发现Aurora B很容易磷酸化USP13，并且值得注意的是，S114 的突变转化为丙氨酸（S114A 突变体）消除了该磷酸化过程。然后，作者生成了一种靶向人类USP13中磷酸化 S114 的位点特异性磷酸化抗体。作者首先制备了USP13磷酸化抗体，该抗体只能特异性检测被Aurora B磷酸化的USP13。此外，作者在 HEK293T 细胞中测试了磷酸S114-USP13抗体，发现磷酸 S114-USP13抗体能够检测在 S114 处过表达的野生型USP13但不是任何突变版本的USP13。此外，作者发现细胞中Aurora B的过表达特异性地增加了 S114处USP13的磷酸化，表明Aurora B确实可以靶向细胞中USP13的S114。最后，磷酸-S114-USP13抗体还能够检测到用 S-三苯甲基-L半胱氨酸处理的细胞中内源性磷酸-S114-USP13的富集。

研究结论：Aurora B在丝氨酸114处磷酸化USP13。

2.USP13在体外和细胞中与Aurora B相互作用

        作者探究这USP13和Aurora B是否可以相互作用。作者使用重组细菌纯化的GST标记和35S-蛋氨酸放射性标记蛋白进行Co-IP，发现USP13和Aurora B确实可以相互作用。作者使用在 HEK293T 细胞中表达的Aurora B和USP13的进行了相互免疫沉淀，发现USP13很容易与Aurora B相互作用。最后，使用来自HeLa细胞的DSP交联裂解物，作者能够检测到内源性USP13和Aurora B之间的相互作用。但作者没有检测到没有交联剂情况下的相互作用，这表明Aurora B和USP13之间的结合可能非常不稳定。然后作者研究了USP13在 S114 的磷酸化是否会影响其与Aurora B的相互作用，有趣的是，作者发现USP13的 S114A 突变体与外源性和内源性Aurora B相互作用的效率较低。

研究结论：Aurora B和USP13之间存在复合物，依赖于USP13在丝氨酸114处的磷酸化，且该磷酸化由Aurora B介导。

3.USP13调节细胞中的Aurora B稳定性

        作者注意到USP13和Aurora B的共表达导致总Aurora B稳态水平的增加。作者推断USP13可以通过去泛素化调节Aurora B水平。作者发现USP13在细胞中的过表达确实能够增加内源性和外源性Aurora B的总体水平，并且后一种效应是剂量依赖性的。

        另一方面，作者比较了Aurora B在指数增长的USP13敲低 (KD) 细胞中的总体稳态水平，与对照细胞相比，当USP13的水平降低时，内源性Aurora B的稳态水平降低。有趣的是，作者还观察到外源Aurora B在USP13-KD细胞中稳定性的增强通过回补USP13后消失。此外，spautin-1对USP13的化学抑制也降低了细胞中的内源性Aurora B水平。

研究结论：USP13调节细胞中的Aurora B稳定性。

4.USP13调节Aurora B的细胞半衰期

        由于USP13增加了Aurora B在细胞中的稳态水平，作者测试了对USP13水平的调节是否直接影响了Aurora B的半衰期。为此，作者用蛋白合成抑制剂环己酮处理过表达Aurora B的细胞，作者发现在过表达USP13后，Aurora B的半衰期增加。相反，作者观察到，在USP13-KD细胞中，内源性Aurora B的半衰期降低了。作者进一步发现过表达USP13的细胞在进入有丝分裂之前，内源性Aurora B的水平增加，而细胞周期蛋白B1的表达没有改变。而USP13-KD细胞在进入有丝分裂时显示出内源性Aurora B水平下降。作者还研究了在有无USP13过表达的情况下在有丝分裂结束时Aurora B的稳定性，在这个细胞周期阶段，Aurora B水平在APC/CCdh1的作用下会下降。作者观察到，USP13的调节并没有改变有丝分裂结束期间Aurora B下调的动力学，表明USP13并不直接对抗有丝分裂结束时的细胞中的APC/CCdh1，而是在细胞周期的G2-M转换期间发挥作用，以便使Aurora B水平正确增加。为了证实这一假设，作者评估了Aurora B在RO-3306（一种可逆的CDK1抑制剂，可阻断G2期的细胞）和环己酮存在下的半衰期，发现当USP13过量表达时，Aurora B的半衰期会增加。

研究结论：USP13调节Aurora B的细胞半衰期。

5.USP13通过酶非依赖机制控制Aurora B的稳定性     

        为了表征USP13对Aurora B的稳定作用所需的可能的分子机制，作者发现USP13催化失活的C345A突变体与其野生型 (WT) USP13都能够上调细胞中外源性和内源性Aurora B的水平。表明即使在没有催化活性的情况下，USP13也能够稳定细胞中的Aurora B。此外，作者探究了USP13在S114处的磷酸化是否调节其他底物。为此，作者在细胞中过表达USP13-WT或-S114A突变体，发现USP13-S114A突变体在稳定Aurora B和Skp2方面的效率低于USP13-WT。相比之下，USP13-WT和-S114A之间在 MCL1（另一种参与细胞存活的USP13底物）的稳定性方面没有差异。

        因此，作者评估了细胞中存在或不存在USP13时Aurora B的泛素化状态，发现USP13的过量表达降低了泛素化Aurora B的水平，而USP13 KD增强了Aurora B的泛素化。此外，USP13-C345A也能降低细胞中泛素化的Aurora B的水平，这可能解释了该突变体稳定Aurora B的能力。

研究结论：USP13可以通过调节Aurora B的泛素化，即去除或编辑Aurora B上存在的泛素化标记来控制Aurora B的稳定性，其机制似乎与其催化活性无关。

6.USP13影响细胞周期的进程

        由于USP13通过细胞周期调节Aurora B水平并微调 Skp2、c-myc和 p53等蛋白质的水平，这些蛋白质也参与其中在细胞增殖方面，作者假设细胞中USP13水平的调节可能会影响它们的细胞周期。为了验证这一假设，作者首先进行了流式细胞术分析，发现 U2OS 细胞中USP13的过表达在24小时后增加了它们的G2/M种群，并且在48小时后增加了它们的>4n种群，表明胞质分裂失败，并表明在USP13水平升高的情况下确实会影响细胞分裂。然后作者通过免疫荧光显微镜分析自由分裂的外源表达USP13的细胞，并观察到磷酸化组蛋白H3的水平增加，表明USP13过表达导致活性Aurora B激酶的水平提高。此外，通过延时显微镜对表达外源USP13的U2OS细胞进行进一步检测，显示进入有丝分裂的速度降低。总体而言，这些分析表明U2OS细胞中USP13的过表达导致G2或前期停滞，磷酸化组蛋白H3水平异常。

        相反，作者发现spautin-1对USP13的化学抑制增加了G1中U2OS 细胞的数量，从而损害了相应的G2/M群体。此外，在spautin-1存在下稳定表达Aurora B-Venus 的U2OS细胞的延时显微镜显示前期细胞数量减少，证实了spautin-1阻碍了它们进入有丝分裂。与通过spautin-1化学抑制USP13的结果一致，USP13-KD细胞的G1群体也显示出轻微增加。最后，用STLC处理细胞显示USP13-KD细胞在有丝分裂中积累的能力降低，表明在没有USP13的情况下，细胞倾向于停留在G1期。

研究结论：细胞中USP13的水平对细胞在周期中不受干扰至关重要。

结论与讨论

        在这项研究中，作者首次报告了USP13和致癌性Aurora B激酶之间存在的分子和细胞联系。USP13的水平对细胞在周期中不受干扰至关重要。USP13与Aurora B相互作用，通过不依赖其催化活性的机制控制其在细胞周期中的稳定性。另一方面，作者发现Aurora B在丝氨酸114处对USP13进行磷酸化，促使它们相互作用。作者的研究结果揭示了在细胞周期中发生的异常情况与一些人类癌症中报道的Aurora B和USP13的异常水平之间的潜在联系。

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原文链接：https://www.nature.com/articles/s41388-020-01396-8