最全免疫组化实验避坑指南，花样百出的问题一次解决~
自从免疫学摘得2018年的诺奖后，免疫学实验就成为了SCI文章进阶高分期刊的最佳辅助。但是做过免疫组化实验的人都知道，看似容易的实验过程，但是其花样百出的问题总是让我们的精神备受摧残。
检测结果阴性、非特异性染色、染色强度不够、着色不均、脱片、干片等，这些最常见的实验问题点，今天一次性汇总解决方式，祝大家都能做出满意的结果！
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1、标本的固定
常见问题：
组织固定不及时或不完全固定，HE染色细胞核发灰模糊，对比不鲜明；免疫组化染色结果不理想，通常组织离体2h后抗原完全丢失。
➤案例示范1
➤案例示范2
解决建议：
① 组织离体后尽快固定，组织块大小为15×15×5mm，切开固定效果好；
② 固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳；
③ 固定时间在4h-48h之间，长时间固定会影响抗原决定簇的暴露，产生阴性结果；
④ 固定液的量要超过组织体积5倍以上。
2、标本的取材，脱水，浸蜡
常见问题：
如果组织脱水、浸蜡不充分，蜡块会出现组织收缩凹陷，而且在免疫组化热抗原修复操作时会容易脱片。
解决建议：
① 梯度酒精脱水尽量彻底充分；
② 二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致组织发硬发脆；
③ 浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分。
3、标本的切片，捞片，烤片
常见问题：
切片太厚，有刀痕，有褶皱，脱片。
➤案例示范1
➤案例示范2
解决建议：
① 切片厚度视组织而定，如同淋巴结、肾等需要比较薄（不超过3um），脑组织需要较厚（尤其是取新鲜标本冰冻制片时），常规都要6-8um最佳，冰冻可切至10um；其他一般如胃肠道、肝胆等等组织，2-4um均可,太厚易掉片，细胞重叠，影响观察。切片角度和刀片新旧程度对切片效果的影响较大，切片角度视切片机型号而异；新刀片容易切出完好的切片。
② 捞片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在40℃左右。
③ 粘片时需准备蛋白甘油，蛋白甘油由鸡蛋蛋清和甘油调配而成，比例为1：1。 先将一滴蛋白甘油涂抹在干净的载玻片上，然后用载玻片从水中将展好的蜡片捞起，平放入烘箱内进行烘干。或者玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性。
④ 烘干温度为50℃，时间为12～24h。
4、标本的脱蜡不完全
常见问题：
脱蜡不全,组织出现异染现象，异染现象一般是苏木素着色不佳，HE染色没有选择性，染色不均匀。有的是伊红染不上。
解决建议：
根据不同的室温，调节脱蜡的时间，原则上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡
5、抗原修复
抗原修复是免疫组化中不可忽略的关键步骤。原因是组织经福尔马林等固定液固定和石蜡包埋后，抗原决定簇与核酸易发生交联，引起蛋白质空间结构的改变，导致抗原决定簇被封闭，是抗原与抗体结合点减少，从而令抗原抗原的阳性检测率及着色强度相对减弱。这种交联在高温加热或是蛋白酶水解作用下会发生可逆反应，恢复蛋白的原有构象，这一过程就是抗原修复。
常见问题：
阳性检测率及着色强度相对减弱。
➤案例示范
经验分享：
① 抗原修复缓冲液有多种，常用的则为柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），EDTA缓冲液（pH8.0-9.0），Tris/Tris-EDTA缓冲液（pH9.0-10.0），或者胰酶法（pH3.5±0.2）；
② 修复液的不同PH值对染色结果的影响比较大；
③ 没有一种抗原修复缓冲液可以适用于所有抗原；
④ 大部分抗原在修复液pH8.0-9.0的范围值可以获得一个普遍较好的修复效果，所以碱性缓冲液应用普遍些。
6、封闭
常见问题：
① 封闭时间过长，会导致阳性信号减弱甚至出现假阴性；
② 封闭时间不足，会导致背景增强甚至出现假阳性。
➤案例示范
解决建议：
① 根据实验实际情况选择合适的封闭试剂和封闭时间。
② 根据二抗系统中是否含有生物素而选择封闭剂。
③ 无生物素的二抗系统可以不使用封闭剂，如Immunoway的RS0011通用型二抗。
④ 卵白素类的二抗系统需要根据生物素的种类选择相应的封闭剂在一抗前处理组织切片。
⑤ 封闭血清一般是和二抗同一来源，可封闭非特异性结合位点，降低背景噪音。也可使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗的来源一致。
7、洗涤
➤案例示范
解决建议：
进行充分洗涤。
8、干片
➤案例示范
解决建议：
加入Tween-20的缓冲液能够更好地防止切片干燥。
9、边缘效应
➤案例示范
解决建议：
组织切片与玻片黏贴牢固，试剂完全覆盖组织防止干片，加入Tween-20的缓冲液能够更好地防止边缘效应。
10、一抗的选择
免疫组化耗时长，步骤繁多，为了得到特异性染色，获得可靠结论，选择合适的一抗十分关键。基本原则是选择选择特异性强，灵敏度高，背景低的抗体，结果稳定、重复再现性良好的抗体。
抗体特异性
常见问题：
抗体特异性差，定位不准确。
➤案例示范1
解决建议：
抗体的特异性是选择抗体最重要的原则，不同抗体特异性不同，组织特异性，细胞特异性，细胞亚定位的特异性需都准确。
抗体的染色强度
常见问题：
检测结果会出现弱阳性。
解决建议：
适当调整抗体稀释比，或者选择染色强度高，高亲和力的抗体。
抗体稀释比的影响
常见问题：
染色结果出现非特异性染色或者是低背景。
➤案例示范
解决建议：
当结果出现非特异性染色或者有背景时，可以适当调整一抗的稀释比例进行改善，特异性强的抗体检测结果不易受稀释比例的影响。
一抗孵育条件
常见问题：
孵育条件对染色结果有影响。
➤案例示范
解决建议：
孵育条件对染色结果略有影响，需筛选合适的孵育条件。
11、不同组织的影响
常见问题：
染色结果与预期不符，检测阴性或者弱阳性。
➤案例示范
解决建议
设置阳性组织切片的对照，因为同一蛋白在不同组织中的表达会有很大的差异。
12、二抗的选择
常见问题：
使用不同的二抗显色系统会出现不同的结果，可能会有弱阳性结果。
➤案例示范
解决建议：
使用多聚物酶标记二抗比普通的HRP直标二抗灵敏度更高，背景更干净，对比更明显。
13、DAB显色
DAB絮状或团状沉积
常见问题：
产生深棕至黑色的DAB絮状或团状沉积于组织切片上。
➤案例示范
解决建议：
① 现配现用：因为DAB显色液配置好了之后极容易产生DAB的沉积，从而导致样本上会出现深棕色的絮状沉淀，干扰结果的判定。
② 显色时间：所有说明书上的显色时间均为一个范围，有的反应迅速的30s-3min，有的反应缓慢的3-20min，应该灵活调整，最好是滴加了DAB显色液后置于显微镜下控制显色时间。
③ 显示时间技巧：可选择一张阳性的片子，用计时器精确计时在显微镜下判断出具体时间后，再对所有片子进行显色，采用相同的时间来界定。一般如果抗体浓度适宜，操作无误，10分钟内肯定能够显色，如果超过该时间，说明一抗比例不够或者封闭太久等等原因。显色时间越短，则说明抗体浓度高或抗体孵育时间过长，需下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间
信号偏弱
常见问题：
信号偏弱。
➤案例示范
解决建议：
适当延长显色时间，滴加了DAB显色液后置于显微镜下控制显色时间。
14、苏木素使用原则
① 不同的苏木素配方的染色时间各有不同，配置的新旧程度染色时间也不同。
② 国际上常用的为Harris苏木素，因为配方中含汞，通常还需要进行分化，返蓝的步骤，但颜色亮丽。
③ 改良的Mayer苏木素配方不需要分化，时间可以根据配置的时间调整染色时间15s-2min。
15、免疫组化的结果分析
①对照组必设。如阴性、阳性及自身对照。
从以下表中可知，只有6、7实验结果有意义。
1-5均因对照组的结果已否定抗体的特异性或因ICH技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，则必须重复实验或换用抗体。
②阳性着色细胞计数法。
在 40 倍光镜下，随机选择不重叠的 10 个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组 3-6 张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。
③灰密度分析法。
通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用 image j 进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。
④分级法。
免疫组化的半定量一般分为三级：弱（+），中（++），强（+++）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱（+）=1，中（++）=2，强（+++）=3。至少随机观察5-10个HPF。然后根据（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3计算出数值；总数值1.5者为(+++)。
16、免疫组化实验6个小tips分享
① 选择实验要做的抗体时，要结合他们的正常组织和癌组织的分别表达率。
② 试剂盒的选择可结合生物素强弱的情况。如：肝组织生物素含量高，S-P试剂盒生物素含量也高，故不能配合使用。
③ 实验前提前清点实验的必需品是否齐全，做好问题与补救的计划方案。
④ 当抗体不够用的情况下，原先买的抗体最好不要用完，留做可能需要的验证试验。新的抗体要尽量同公司，同批号。
⑤ 温度过低时，可先把二甲苯整罐放进烤箱加热，或者可把片放在二甲苯里一起加热脱蜡，这样效果会更好；若温度适宜，那还是在室温下脱蜡，要不可能会适得其反。时间也是适情况而定。
⑥ 抗体反复冻融对导致效价降低；同时抗体要防止污染，不可用塑料保存，塑料可吸附抗体。
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