MLR混合淋巴细胞反应实验

一、MLR混合淋巴细胞反应实验简介

两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLAⅡ类抗原中D和DP抗原（淋巴细胞鉴定的抗原，SD抗原）不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此为双向混合淋巴细胞培养；若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养。两个个体间HLA抗原差异程度越大，反应越强烈，可通过细胞数量、形态检查或3H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。如用经照射的、已知D位点抗原的纯合子分型细胞作为刺激细胞，则可检测待检者的D位点抗原型别。若待检者抗原与标准HLA-D抗原相同，MLC不发生增殖，此为HLA-D抗原阴性分型法。 EB病毒转化的B淋巴母细胞表达高水平的HLAⅡ类抗原，常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。

二、实验所需材料及试剂

丝裂霉素C、NBS

三、实验步骤

分别取C57BL（H-2b）和Balb/C（H-2d）小鼠脾脏制备细胞悬液，Balb/C小鼠脾细胞悬液（2X107/ml）加丝裂霉素C（50微克/ml ）处理，37oC，30min，培养液洗涤3次后用5%NBS培养液配制细胞悬液（5X106/ml），作为刺激细胞，加入96孔培养板，5X105/0.1ml/孔； 再加入C57BL脾细胞悬液，为反应细胞，也是5X105/0.1ml/孔；另设单独刺激细胞孔和单独反应细胞孔，均为三复孔。 CO2孵葙培养5天，加3H-TdR 0.5 微居/孔，再培养12~16h后，收集细胞于玻璃纤维滤纸上，干燥后用液闪法测定cpm值， 根据以下公式计算刺激指数（SI ）：

SI＝（混合反应细胞孔cpm－刺激细胞孔cpm值）/ 反应细胞孔cpm值

四、实验注意事项

1、注意无菌操作。

2、刺激细胞接受照射剂量要准确，使细胞暂时存活，但失去增殖的能力。

3、可用Raji或Daudi细胞作为刺激细胞，也可将不同的细胞混合作为刺激细胞。

五、实验所需试剂清单

序号 产品名                 货号             CAS 备注

1. N-溴代丁二酰亚胺(NBS)   JQ0005 128-08-5

2. 丝裂霉素 C                HXH502136 50-07-7