去泛素化酶USP19通过分子伴侣介导的自噬促进TANK结合激酶1降解

2023-10-25 23:25 作者:安提海拉生物 0人读过 | 我要投稿

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今天推荐的是由深圳大学医学院免疫学系在2021年7月29日发表于Aotuphagy（2020IF：16.016，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Weilin Chen教授，研究表明USP19（泛素特异性肽酶19）通过分子伴侣介导的自噬促进TBK1（TANK结合激酶1）降解。

研究背景

TBK1（TANK结合激酶1）是先天免疫反应所需的必需受体蛋白，但调控TBK1稳定性的机制，尤其是那些通过自噬调节的机制，仍然知之甚少。

摘要部分

在这里，作者证明USP19（泛素特异性肽酶19）通过分子伴侣介导的自噬（CMA）与TBK1溶酶体相互作用并促进其降解。作者观察到TBK1具有典型的CMA基序，可减弱参与CMA的关键蛋白的作用或抑制CMA阻止的USP19介导的TBK1降解。此外，巨噬细胞中USP19缺陷导致TBK1升高和水泡性口炎病毒(VSV)感染后I型干扰素信号通路的激活。一致地，小鼠中巨噬细胞特异性usp19敲除导致VSV复制减弱和体内VSV感染抵抗。总而言之，作者的结果表明USP19是TBK1的关键调节剂，并揭示了USP19在CMA介导的TBK1降解和传染病中的作用。

研究内容

1.USP19促进TBK1溶酶体降解

TBK1是对病毒和细菌感染的先天免疫反应的关键。为了确定可能调节TBK1稳定性的去泛素化酶，作者将TBK1和DUB表达质粒共转染HEK293T细胞，并通过免疫印迹法分析去泛素化酶。作者发现USP19可以促进TBK1的降解。免疫印迹法显示，TBK1蛋白水平以USP19剂量依赖的方式减少。此外，与对照组相比，USP19在293T细胞中的过表达降低了TBK1的半衰期。这些结果表明，USP19促进了TBK1的降解。蛋白质降解主要通过两种途径发生：蛋白酶体依赖性途径和溶酶体依赖性途径。作者用蛋白酶体抑制剂（MG132）、溶酶体抑制剂（CQ）、3-MA或自噬体融合抑制剂Baf-A1处理这些细胞。只有CQ处理能抑制TBK1的降解，表明USP19以溶酶体依赖性的方式促进TBK1的降解。

由于USP19是一种去泛素化酶，作者接下来探究了TBK1蛋白泛素化状态是否受到USP19的影响。HEK293T细胞转染泛素、USP19和TBK1表达质粒，然后用MG132或CQ处理，作者发现USP19调节TBK1降解与泛素无关。此外，USP19的过表达并不影响TBK1的聚泛素化。作者接下来研究了USP19的去泛素化酶活性是否影响TBK1蛋白水平。作者构建了一个含有C607S替换的无酶USP19突变体质粒（Flag-USP19 C607S）。免疫印迹分析表明，USP19促进TBK1的降解与它的去泛素化酶的活性无关。

研究结论：USP19以溶酶体依赖性的方式促进TBK1的降解，但与USP19的去泛素化酶活性无关。

2.TBK1通过其激酶域(KD)与USP19泛素特异性肽酶(USP)域相互作用

为了研究USP19是否可以与TBK1相互作用，作者在293T细胞中表达了Flag-USP19和MYC-TBK1质粒并进行了免疫共沉淀试验。作者观察到USP19与TBK1相关。由于TBK1是参与抗病毒免疫反应的重要受体，作者还在HeLa和THP1细胞中检测到USP19和TBK1之间的内源性相互作用。为了进一步证实这些结果，作者进行了体外结合测定，结果表明USP19可以在体外与TBK1相互作用。作者的结果还表明USP19 C607S可以与TBK1相互作用。此外，作者构建了三个截断的TBK1突变体来探索哪些域介导了与USP19的这种相互作用。这些截断突变体的免疫共沉淀实验表明，TBK1ULD+CC域截断突变体无法与USP19相互作用，而TBK1WT、KD和KD+ULD仍可与USP19相互作用。这些数据支持TBK1通过其激酶域与USP19相互作用的假设。

研究结论：USP19和TBK1分别通过它们的USP和激酶结构域相互作用。

3.USP19通过伴侣蛋白介导的自噬促进TBK1降解

接下来，作者研究了USP19对TBK1的负向调节的机制。以前的研究表明，USP19促进自噬，作者的数据证实，过量表达USP19，而不是USP19 C607S增加了HeLa细胞的LC3B裂解。然而，作者还发现，只有溶酶体抑制剂CQ可以抑制TBK1的降解，表明USP19促进TBK1的降解与巨噬作用无关。

此外，在比较不同物种间TBK1的氨基酸序列后，作者发现TBK1表现出一个典型的CMA基序（KFDKQ），表明USP19可能以CMA依赖的方式促进TBK1的降解。LAMP2A和HSPA8是参与CMA的核心蛋白：HSPA8识别目标蛋白的CMA基序并与之相互作用，而位于溶酶体膜上的LAMP2A则促进目标蛋白进入溶酶体进行降解。免疫荧光染色显示，USP19与TBK1和LAMP2A共同定位，共同免疫沉淀实验表明，USP19与TBK1、LAMP2A和HSPA8相互作用。此外，作者还通过溶酶体分离实验证明了TBK1和USP19蛋白在溶酶体中的存在。就其对TBK1稳定性的影响而言，LAMP2A或HSPA8的过表达增强了USP19介导的TBK1降解，而CQ处理则抑制了它。作者接下来构建了一个TBK1CMA-动点突变体质粒，含有Q588A的替换（MYC-TBK1Q588A），并将MYC-TBK1或MYC-TBK1Q588A质粒转染到有或没有Flag-USP19质粒的tbk1-基因剔除的RAW264.7细胞。结果显示，USP19没有促进TBK1 CMA基序突变体蛋白的降解。有趣的是，USP19的过表达增加了LAMP2A和HSPA8在mRNA和蛋白水平的表达，并促进了HSPA8和LAMP2A之间的相互作用。这一发现表明，USP19可能具有多种生物学功能，包括调节LAMP2A和HSPA8的mRNA表达。重要的是，siRNA介导的对LAMP2A或HSPA8表达的敲低抑制了USP19介导的TBK1降解。VER-155,008是一种可以抑制CMA的HSPA8抑制剂，而Torin1是一种可以诱导CMA的强效mTOR抑制剂。当作者用VER155,008处理HeLa细胞时，作者观察到USP19调节的TBK1降解大大减少；相反，Torin1处理明显促进USP19调节的TBK1降解。

研究结论：USP19通过CMA促进TBK1的降解。

4.USP19通过促进TBK1降解负向调节IFNB产生和细胞抗病毒反应

TBK1是一种必需的丝氨酸/苏氨酸激酶，参与病毒触发的I型IFN信号传导。作者设计了一个USP19特异性siRNA来探索USP19是否调节了TBK1依赖性抗病毒反应。qPCR和ELISA显示USP19敲低增强了VSV诱导的THP-1或HeLa细胞中的IFNB1表达，但CMA抑制剂并未进一步促进IFNB1表达。THP-1或HeLa细胞中的USP19敲低也显着促进了VSV诱导的CCL5和CXCL10 mRNA表达，表明USP19通过促进CMA介导的TBK1降解负向调节细胞抗病毒免疫反应。

病毒感染可刺激巨噬细胞产生I型干扰素，然后触发Janus激酶(JAK)——信号转导和转录激活因子(STAT)通路的激活以及干扰素刺激基因(ISG)的表达。作者发现这些ISG在USP19敲低细胞中的表达增加，并且用VER-155,008处理的USP19敲低细胞和对照之间没有显着差异。为了观察细胞中VSV的复制，作者用GFP标记的VSV感染了THP-1和HeLa细胞。与对照细胞相比，USP19敲低细胞中的GFP荧光强度显着降低。流式细胞术分析证实，与对照细胞相比，USP19敲低细胞中GFP+细胞的百分比显着降低。作者还测试了内源性TBK1水平，结果表明USP19敲低明显抑制了内源性TBK1降解。这些结果表明，USP19敲低通过抑制TBK1降解来增强IFNB产生和细胞抗病毒反应。

为了表明USP19靶向TBK1以负调节抗病毒反应，作者进行了IFNB1和干扰素刺激反应元件(ISRE)启动子报告基因检测。过表达USP19抑制了TBK1，上游调节因子DDX58/RIG-I和MAVS过表达诱导了IFNB1和ISRE启动子活性。免疫共沉淀分析结果显示USP19和DDX58、MAVS、IRF3、IFIH1/MDA5、CGAS或STING1之间没有相互作用。这些数据表明USP19通过促进TBK1降解负向调节TBK1依赖性细胞抗病毒反应。

研究结论：USP19通过促进TBK1降解负向调节IFNB产生和细胞抗病毒反应。

5.敲除人PBMCs中的USP19促进VSV诱导的IFNB产生和细胞抗病毒反应

为了探索以上发现的潜在临床价值，作者接下来探究了USP19对原代人类外周血单核细胞（PBMCs）中细胞抗病毒反应的影响。USP19-siRNA 处理抑制了 PBMC 中 USP19 的表达。感染VSV后，USP19敲低PBMC表达更高水平的IFNB1 mRNA，且产生比VSV感染的对照细胞更多的IFNB蛋白。在感染了VSV的USP19基因敲除的PBMC中，病毒的复制受到了抑制。同样，经VER-155,008预处理的USP19-基因敲除的PBMCs也没有表现出比USP19-基因敲除的PBMCs更强的病毒反应。接下来，作者探究了USP19对VSV诱导的信号通路激活的影响。TBK1蛋白的表达在USP19敲低的PBMCs中大幅上升，这表明USP19通过靶向TBK1而对抗病毒反应产生了消极影响。最后，作为干扰素的下游信号分子，STAT1和STAT2在USP19基因敲低的PBMC感染VSV后明显增加。

研究结论：USP19对IFNB的产生和细胞的抗病毒反应有负向调节作用。

6.USP19缺乏通过抑制CMA介导的TBK1降解增强了小鼠腹腔巨噬细胞中I型干扰素的产生和抗病毒反应

为了进一步研究USP19在体外和体内抗病毒信号传导中的作用，作者构建了Usp19fl/fl小鼠。qPCR分析表明，usp19敲除显着促进了VSV或转染的poly(I:C)诱导的小鼠色调巨噬细胞中的Ifna4和Ifnb1表达，而VER-155,008没有这种效果。在来自Usp19fl/fl小鼠的腹腔巨噬细胞中，作者发现USP19负向调节单纯疱疹病毒(HSV)诱导的Ifnb1、Ifna4和Isgs mRNA表达。此外，作者的结果表明，Ifnb1 mRNA在usp19基因敲除巨噬细胞中以较高水平表达，这些巨噬细胞受到Toll样受体刺激物的刺激。这些结果证实USP19通过靶向TBK1负向调节Ifnb1表达。同样，在VSV感染的巨噬细胞中敲除usp19表达更高水平的Ccl5和Cxcl10 mRNA和Isg mRNA。此外，敲除usp19的小鼠腹膜巨噬细胞在OAS1和EIF2 AK2/PKR下游表达更高水平的I型干扰素。另一方面，巨噬细胞中USP19的缺失导致LAMP2A蛋白表达降低，表明usp19敲除削弱了巨噬细胞中的CMA。作者接下来通过荧光显微镜和流式细胞术分析监测VSV复制，以检测VSV-GFP感染后的GFP阳性细胞。结果表明，与Usp19 WT细胞相比，usp19缺陷降低了GFP强度和GFP阳性细胞的百分比。VSV RNA水平的qPCR分析也表明usp19敲除显着抑制了VSV复制。

作者进一步研究了USP19对VSV诱导的信号通路激活的影响。在usp19基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞中，VSV感染后IRF3磷酸化和TBK1蛋白的表达显着升高，而其他参与VSV诱导信号通路的蛋白质不受影响，表明USP19靶向TBK1并促进其降解以负调节抗病毒反应。最后，在usp19基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞中，VSV感染后STAT1和STAT2磷酸化显着增加。

图7.巨噬细胞中的USP19缺陷通过抑制CMA介导的TBK1降解增强了VSV诱导的I型干扰素产生和抗病毒反应

研究结论：USP19缺乏会增强I型干扰素的产生并促进小鼠腹腔巨噬细胞中VSV诱导的病毒信号激活。

7.USP19缺陷增强了宿主对VSV感染的反应

在体内，作者通过腹腔注射VSV对Usp19fl/fl小鼠、usp19fl/flLyz2-Cre小鼠和VER-155,008预处理的usp19fl/flLyz2-Cre小鼠进行处理。qPCR分析显示，VSV感染后，usp19fl/flLyz2-Cre小鼠在各个器官表达的Ifna4和Ifnb1水平高于Usp19fl/fl小鼠，而且VER-155,008处理并没有进一步促进VSV感染后usp19fl/flLyz2-Cre小鼠的Ifna4和Ifnb1表达。在usp19fl/flLyz2-Cre小鼠或经VER-155,008处理的usp19fl/flLyz2-Cre小鼠的这些器官中，VSV滴度和复制明显低于Usp19fl/fl小鼠。酶联免疫吸附试验的结果也表明，与Usp19fl/flLyz2-Cre小鼠的血清相比，VER-155,008预处理的usp19fl/flLyz2-Cre小鼠血清中的IFNB产生量明显增加。作者还观察到，与Usp19fl/fl小鼠相比，感染VSV后，usp19fl/flLyz2-Cre小鼠肺部的炎症细胞浸润较少，组织损伤轻微，而usp19fl/flLyz2-Cre小鼠的炎症细胞浸润与VER-155,008预处理的usp19fl/flLyz2-Cre小鼠相比，没有明显差异。更重要的是，与Usp19fl/flLyz2-Cre小鼠相比，usp19fl/flLyz2-Cre小鼠在总体存活率方面表现出对VSV感染的高度抗性。