LC-MS/MS蛋白全序列验证

随着现代医药工业的进步，序列分析已成为蛋白质、多肽、抗体、疫苗类生物药物分子以及胶原蛋白等医疗器械类产品的研发和质量控制中的重要环节。蛋白质的全序列验证分析扮演关键角色，能够确认重组蛋白质多肽类生物制品的完整准确表达，确保产品质量和有效性。

百泰派克生物科技BTP基于CNAS/ISO9001双重质量认证体系，建立蛋白测序平台，该平台配备多台N端序列分析仪、超高效液相色谱高分辨质谱联用、经过多轮优化的蛋白从头测序算法平台。结合先进的分析设备和算法，BTP能够对蛋白质进行全序列验证分析，确保蛋白质的完整性和准确性，以满足您的研究和质量控制需求。

液质联用（LC-MS/MS）蛋白全序列验证分析:

蛋白全序列验证分析的一般流程是使用特异性蛋白酶对蛋白质分子进行酶解切割，酶解后的供试品是复杂的肽段组成的混合物，然后通过液质联用平台对供试品进行质谱分析。

首先，是对样本进行前处理，即根据蛋白全长理论氨基酸序列结合质谱级别蛋白酶酶切位点信息选择至少五种蛋白酶对蛋白进行酶切，提高酶切效率，以便获得更高的覆盖度。实际实验中可以从多种蛋白酶（Trypsin、Chymotrypsin、Asp-N、Glu-C、Lys-C和Lys-N等）中选择合适的蛋白酶或者组合酶切的方式对靶蛋白进行酶切；其次，使用液质联用Nano-LC-MS/MS 平台对酶切之后的肽段混合物进行分析，得到总离子流色谱图和质谱原始数据；然后，以所测定蛋白的理论序列建立本地数据库，通过专业分析软件匹配并计算每一种酶切之后鉴定到的肽段；利用酶切位点之间的互补性对蛋白序列进行拼接，最终实现蛋白全序列验证。

案例示意图:

抗体轻链全序列验证分析示意图

一般流程：

1、使用多种蛋白酶组合酶切的方式对蛋白进行酶切，提高酶切效率，以便获得蛋白每一个氨基酸的序列信息。

2、使用 Nano-LC-MS/MS 液质联用高分辨平台对样品进行分析。

3、将得到的质核比信息与理论序列建立的数据库进行比对。

4、拼接每种酶切方式鉴定到的肽段，得到蛋白是否完整正确表达的信息。

实验仪器:

液相色谱仪（Easy-nLC1200）|电喷雾-组合型四级杆-Orbitrap 质谱仪（Q Exactive™ HybridQuadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer ）

应用:

蛋白质、多肽、抗体、疫苗、胶原蛋白等生物制品的氨基酸全序列验证分析|蛋白质翻译后修饰和化学修饰分析|蛋白质、多肽、抗体、疫苗、胶原蛋白等生物制品的氨基酸序列突变分析

常见问题:

问题1：覆盖度能反映什么问题呢？若覆盖度不足100%该怎么处理？ 

回答：覆盖度是指被测序到的序列占全序列大小的比率。反应了我们的测序结果对于我们蛋白的覆盖情况，若覆盖率为100%代表样品经酶解处理之后得到的序列与目标序列高度吻合，若覆盖率不足100%，我们会审查蛋白质数据和序列，查看缺失多少序列以及哪些理论上的肽段未检测到；根据实际结果判断是否继续使用现有方法和酶解处理，重新获得肽遗失的位置，还是蛋白样品本身发生了突变，需要进行从头测序分析。 

问题2：想要进行测序的蛋白质分子量较小，如何进行蛋白样品制备？ 

回答：如果蛋白分子量比较小，可以使用浓度较高的SDS-PAGE胶将蛋白质进行分离，然后对蛋白胶进行考马斯亮蓝染色，再将与目的蛋白大小一致的蛋白条带切割下来，切下来的蛋白胶条用于质谱鉴定。