Nature背靠背 | 肺类器官与人肺干祖细胞新谱系

肺泡是我们的呼吸系统的最终末结构，主要作用是氧气和二氧化碳的气体交换，是人体呼吸作用的重要场所。肺部的结构是非常复杂的，很多呼吸系统疾病都是因为肺泡组织遭到侵染，最终危及生命，比如重症新型冠状病毒肺炎，肺纤维化 (IPF) 和慢性阻塞性肺病 (COPD)等等。尽管肺泡如此重要，但是由于肺泡细胞组织获取困难以及肺泡细胞培养技术不成熟，使我们对人的肺泡以及上述疾病机理的了解不够深入。

过去很长时间，人终末肺泡区域被认为由两种上皮细胞组成，1型肺泡上皮细胞（AT1）和2型肺泡上皮细胞（AT2)。其中AT2细胞被认为是区域性干细胞或祖细胞，损伤修复时可以自我增殖和分化成AT1细胞。后来，科学家们又在小鼠中发现了其它种类的终末气道干细胞，但由于小鼠和人肺的结构存在很大差异，在解剖学上两者连接的区域截然不同，因此小鼠模型里获取的信息并不完全适用于人（图1）。

近年来，单细胞测序技术和体外干细胞的类器官培养技术的大力发展，让科学家们对人肺泡中的细胞谱系有了更深入的了解。最近，Nature背靠背发表了两篇关于人肺干祖细胞新谱系的力作，通讯作者分别为宾夕法尼亚大学的Edward E. Morrisey和杜克大学的Purushothama Rao Tata。两篇文章的相似之处都是先用单细胞测序发现了人肺的新细胞谱系，然后用类器官体外培养方法进一步证明了新谱系的生态轨道。

Morrisey通过类器官模型发现一种独特的在人体中存在而小鼠中不存在的新型细胞——呼吸道分泌细胞（respiratory airway secretory, RAS）,其能够充当AT2的单向性祖细胞，这种谱系分化受到Notch和Wnt信号传导的调节。在COPD中，RAS转录及AT2细胞的状态异常，并与人类和雪貂的吸烟暴露相关。

通过对来自五名健康非吸烟者供体的显微解剖肺组织scRNA-seq分析，Morrisey团队观察到远端肺组织的两个表达典型标记SCGB1A1的分泌细胞群，其中一群还表达高水平的SCGB3A2，两群细胞表现出不同的基因表达谱，而SCGB3A2+细胞几乎不在近端气道中表达（RAS细胞）。进一步通过基于模型的单细胞转录组学（MAST）对SCGB1A1+分泌细胞、RAS细胞和AT2细胞进行基因表达分析，该团队发现RAS可能作为AT2的祖细胞。

接下来，该团队使用SCGB3A2-mCherry人胚胎干 (hES) 细胞报告系，利用它可以产生SCGB3A2+人气道上皮细胞来评估RAS细胞和AT2细胞之间的关系。在气道培养基中，iRAS可以维持SCGB3A2的表达，当转入肺泡培养基时，SCGB3A2表达迅速下调，参与AT2细胞成熟的SFTPC启动表达。如果把AT2重新转移到气道培养基中，并未激活SCGB3A2表达，说明这是一个单向分化的过程。

为了确定RAS-AT2轴是否在COPD中被破坏，该团队对一组接受肺移植的COPD患者的外周肺组织进行了scRNA-seq分析，在COPD肺中存在两个未出现在正常供体数据集中的AT2细胞簇，其中一个高表达SCGB3A2。对一组在过去一年内是活跃吸烟者或已停止使用烟草的患者进行分析发现，SCGB3A2+LAMP3+（AT2标记）细胞的百分比随吸烟指数的增加而增加。对是否暴露于香烟烟雾中6个月的雪貂的远端肺进行IHC分析也同样显示，SCGB3A2+LAMP3+双阳性细胞数量在暴露组中增加。这些数据表明，COPD中RAS细胞向AT2细胞分化的功能存在障碍（图2）。

Tata的文章利用显微解剖远端气道的空间转录组学和单细胞分析，确定并描述了之前从未被表征过的分子上不同的3种TRB细胞类型—气道相关的LGR5+成纤维细胞、TRB特异性肺泡0型 (AT0) 细胞和TRB 分泌细胞 (TRB-SC)，同时揭示了驱动双能AT0细胞状态分化为正常或病理状态的机制，不仅修正了人类肺细胞图谱和谱系轨迹，而且提示了灵长类肺部再生和疾病中的上皮过渡状态。

为了在分子和空间上建立人类气道细胞图谱，研究人员同时采用了两种方法（图3）。首先，使用Visium技术对肺部切片进行了空间转录组（ST）分析；其次，从周围组织显微解剖远端气道（直径小于1毫米并与肺泡相邻），分离后，进行单细胞转录组分析。将聚类的18个不同的上皮细胞聚类根据SFTPB表达的存在与否分为两个不同的群体，即SFTPB-群体（不表达）和SFTPB+群体（表达）。将这些基因的表达模式与ST数据进行直接比较，并综合分析单细胞RNA测序（scRNA-seq）和ST数据，结果显示SFTPB-群体标记物与近端气道相关，而SFTPB+群体的标记物则存在于远端气道。此外，SFTPB-和SFTPB+群体标记物的表达模式将气道分隔成四个组织学上不同的区域，而且一些属于SFTPB+群体和位于TRB的细胞类型在以往研究的健康人类肺部scRNA-seq数据中并不存在。以此确定了之前尚未在人类气道中被表征过的区域特异性标志物和细胞类型。

随后，研究人员发现了共表达SFTPB但在SCGB1A1、FOXJ1、SCGB3A2和SFTPC表达上不同的上皮细胞类型，进一步的分析表明，这些细胞类型中的每一种都显示出远端气道内的特定定位模式。第一类是表达SFTPB和SCGB3A2但缺乏SCGB1A1、FOXJ1和SFTPC的细胞群，是TRB特有的，称为TRB分泌细（TRB-SC）；第二类是SFTPB+SCGB3A2+SCGB1A1+ 的细胞，位于末端细支气管近端的远端气道，称为末端细支气管前分泌细胞（pre-TB-SC）；第三类以SFTPB、SCGB3A2和SFTPC的表达为特征，与呼吸性细支气管相邻的肺泡间隔有关，在远端肺泡囊中很少见，由于这些细胞与典型肺泡上皮细胞（肺泡1型和肺泡2型细胞）具有相似的转录谱和定位，被称为肺泡0型上皮细胞（AT0）；第四类，是一种分泌纤毛的“混合”细胞类型，其特征是SCGB3A2、SFTPB和FOXJ1的共表达，称为SCGB3A2纤毛细胞 (SCGB3A2-CC)。此外，研究人员还观察到四种类型的基底细胞群，通过比较离体远端和近端气道上皮细胞的表型特性，最终确定了人类肺中分子、空间和表型不同的基底细胞亚群。

研究人员将scRNA-seq数据中的成纤维细胞与之前描述的人类肺参考数据集进行比较与注释，除了已被确定的7类细胞聚类，本文研究人们还发现了一类特有的成纤维细胞群——LGR5+ 成纤维细胞，表现出独特的转录调控（图4）。随后远端基底细胞的共培养实验证实，位于远端气道中的LGR5+ 成纤维细胞可以支持邻近基底细胞的生长并维持其分子特征，表明LGR5+ 成纤维细胞可作为远端气道上皮细胞的生态位。

进一步地，研究人员利用计算机模拟预测，并经过类器官模型验证，发现AT2可首先转化为AT0，然后AT0在EGF缺失时转化为TRB-SC（TRB-SC组织成类似于人类肺部病理状态下的细支气管化结构的三维上皮囊肿），或者在添加血清后转变为AT1。与此同时，研究人员还发现，AT0细胞和TRB-SC在灵长类动物中是保守的，并在人类肺发育过程中是动态出现的。使用非人类灵长类动物肺损伤模型，结合急性肺损伤和IPF患者的组织标本，研究人员发现AT0主要分布在轻度纤维化区域，这些区域与正常AT2区域相邻并散布在它们之间，提示AT2正向AT0过渡；相比之下，TRB-SC样细胞大多出现在类似于“细支气管化区域”的经典组织学描述的严重的纤维化区域（图5）。由此表明AT2可以获得双能AT0细胞状态，并依据周围环境而转变为AT1或TRB-SC。

更多的人呼吸道和肺的细胞谱系以及生态轨迹的发现将会为理解呼吸疾病的病理改变、体外疾病建模及药物研发提供更多理论基础和应用的可能性。Nature上这两篇背靠背发表的文章包含了丰富的原始数据，在人肺泡领域的研究中具有里程碑的意义。