莫非事务所 | 后疫情时代，新冠病毒研究的各种电镜技术汇总篇

尽管节点不一，全球各地正眼看着走出新冠的阴霾。这场新冠疫情的罪魁祸首，就是SARS-CoV-2 病毒。这种病毒在电子显微镜下可以观察到一圈皇冠样的凸起，因而被称为冠状病毒，区别于以往出现的SARS冠状病毒（2002年）和MERS冠状病毒（2012年），进而被命名为新冠病毒。

新冠病毒的鉴定方法主要有全基因组测序、Real Time RT-PCR以及电子显微镜技术等。其中电镜技术具有“所见即所得”的优势，可以直接观察新冠病毒形貌，从而确定其种属，具有直观便捷等优点。此外，高分辨冷冻电镜还能解析病毒的近原子分辨率结构，尤其是关键功能结构域蛋白的结构，为基于结构的药物设计提供重要依据，是揭开新冠病毒神秘面纱极其重要的科学利器。 下面，我们就来汇总一下可以用于新冠病毒研究的各种电镜技术。 01

常温电镜

常温透射电镜TEM

最常见的是负染电镜技术，即用重金属盐直接对分离出来的病毒进行染色，在120 kV常温透射电镜下来直接观察新型冠状病毒的形态、大小等特征，这种技术具有快速便捷的优势（见图1）。 如果需要进一步探究病毒侵染宿主及其扩增过程，这就需要采用组织切片电镜技术，即用分离出的病毒感染体外培养细胞，经过常规透射电镜制样（固定/脱水/渗透/包埋/切片/染色），进而在常温透射电镜下来观察新型冠状病毒在细胞内的形态、大小、分布及侵染释放过程（见图2）。

图1 常温透射电镜下SARS-CoV-2 病毒照片（中国疾控中心）

图2 常温透射电镜下SARS-CoV-2 病毒照片（武汉病毒所）

常温扫描电镜SEM

如果需要更直观地观察到病毒的立体形貌及细胞的侵染过程，常规扫描电镜技术也可以实现这一需求：分离出的病毒感染体外培养细胞，经过常规扫描电镜制样技术（固定/脱水/临界点干燥/镀膜），在常温扫描电镜下来观察病毒（见图3-1）。当然，也可以给病毒图片涂上醒目的颜色便于观察（见图3-2）。

图3-1 常温扫描电镜下SARS 病毒照片（新加坡国立大学）

图3-2 常温扫描电镜下SARS-CoV-2 病毒照片（美国国立过敏与传染病研究所）

大体积扫描电镜和双束电镜

在三维大体积中揭示病毒对宿主的感染情况，如感染量及亚细胞器定位分布，对揭示病毒的感染机制及宿主的发病机制至关重要。

目前有两种高度自动化的大体积三维成像电镜技术：连续切面电镜成像技术（Serial Block Face Imaging, SBFI）和聚焦离子束扫描电镜技术（Focused Ion Beam SEM)

。可采用常规树脂包埋块或高压冷冻后树脂包埋等方法对病毒感染的细胞或组织进行样品制备，然后进行自动化三维电镜成像。SBFI技术使用仪器内置钻石刀自动完成边切片边扫描成像，能够处理的样品体积比较大，可以达到1mm，结合Multi-energy deconvolution技术可实现Z轴分辨率10nm的各向同性分辨率成像（见图4）。FIB-SEM聚焦离子束扫描电镜因采用离子源对样品进行切割，更稳定，可实现更高的Z轴分辨率，相对来说可处理的样品体积会小一些（见图5）。

图4 大体积扫描电镜下Cowpox病毒

图5 常温双束电镜下Human Cytomegalovirus病毒（乌尔姆大学）

02

冷冻透射电镜cryoEM

冷冻透射电镜看全貌

如何才能观察到真实天然的新型冠状病毒呢？冷冻电镜技术给出了答案：直接将分离纯化的病毒颗粒快速投入到液氮冷却的液态乙烷中冷冻，形成无定形冰层，保留灭活病毒的天然状态，再放到200 kV或者300 kV冷冻电镜下观察到的就是完整灭活新冠病毒的真实面貌（见图6）。

图6 冷冻电镜下SARS-CoV-2 灭活病毒（南方科技大学）

单颗粒分析技术获取高分辨结构

新冠病毒药物设计和疫苗研发可以采取基于结构的药物设计策略，冷冻电镜单颗粒分析技术可以大大加速这个过程，通过深入的高分辨结构研究，尤其是功能结构域蛋白结构、相关的受体蛋白结构以及二者结合态结构，可以进一步揭示病毒侵染宿主细胞的详细过程。根据已有病毒基因序列（刺突糖蛋白)，进行病毒基因扩增、载体构建、重组病毒蛋白表达、纯化、浓缩、冷冻制样，然后放到200 kV或者300 kV冷冻电镜中收集数据，通过三维重构得到其近原子分辨率（3.5埃）的高清结构（如图7）。 除此之外，科学家利用冷冻电镜解析了新冠病毒受体ACE2全长蛋白结构，以及新冠病毒刺突糖蛋白受体结合结构域与ACE2全长蛋白的复合物结构（2.9埃和3.5埃，西湖大学），又成功解析了新冠病毒RdRp（RNA依赖的RNA聚合酶）-nsp7-nsp8复合物的近原子分辨率结构（2.9埃，上海科技大学-清华大学）。

图7 冷冻电镜下SARS-CoV-2 病毒的刺突糖蛋白（德克萨斯大学奥斯汀分校）

冷冻电子断层扫描看细胞原位结构

如果要进一步研究病毒侵染细胞的详细过程，进行细胞原位分析研究，可以采用另外一种冷冻电镜技术 –

冷冻电子断层扫描技术（Cryo-ET）

，其工作流程是将细胞进行冷冻制样（冲入式或者高压冷冻）在荧光显微镜下锁定标记好蛋白的位置，再通过光电联用 (CLEM) 技术转化为电镜可识别的坐标，进而使用冷冻双束电镜进行冷冻减薄或者冷冻减薄提取制备冷冻薄片，然后放到300 kV冷冻电镜上进行冷冻电子断层扫描成像（如图8）。Cryo-ET提供了结构构象的信息，有助于理解扰乱病毒功能的新机制，从而为抗病毒药物的开发提供依据。

图8 冷冻电子断层扫描技术获取的Pseudorabies病毒图片（中国科技大学）