一文快速了解功能基因高通量筛选流程
基因的具体功能一直是科学研究的热门方向，但以人的基因组为例，大约有2万个基因，如果挨个系统性研究，那工作量太大而基本无法实现。因此，高通量基因筛选方式应运而生。从一开始的RNAi，CRISPR，到目前流行的自定义寡核苷酸池，逐步实现了更多文库类型、更多筛选模式、更多应用方向的筛选需求。 在功能基因高通量筛选过程中，为了获得更加可靠的结果，往往会将混合筛选得到结果进行阵列筛选验证。这篇文章巧妙的利用寡核苷酸池构建CRISPR混合慢病毒文库，将混合筛选得到候选基因进行siRNA阵列验证，实现了寡核苷酸、CRISPR及RNAi的梦幻联动。
Background
： 在已知的SARS-CoV-2蛋白相互作用组的基础上，利用OLS寡核苷酸池构建CRISPR文库，筛选与SARS-CoV-2病毒及3三种季节性冠状病毒感染相互作用的宿主蛋白，为抗击COVID-19提供潜在靶点
Workflow
:
1. 寡核苷酸池设计
：选取332个宿主蛋白基因，每个基因设计10条sgRNA，加上对照，总计3944条sgRNA
2. 寡核苷酸池应用
：合成寡核苷酸池，溶解稀释后，PCR扩增添加克隆位点，纯化回收PCR产物
3. 重组质粒载体构建
：生成lentiGuidePurov2 sgRNA混合质粒文库，将混合质粒电转至Endura感受态细胞，刮取菌落，提取质粒
4. NGS评估sgRNA分布
：扩增sgRNA靶向区域，在扩增子中添加illumina测序接头、随机核酸切口及分子条形码，切胶回收扩增子，Ilumina NextSeq平台测序
5. 混合慢病毒文库构建
：将重组lentiGuidePurov2 质粒, 辅助质粒VSV-G和HIV Gag-Pol共转 Lenti-X 293T
TM
细胞，收集、纯化、浓缩病毒，等分后-80℃保存
6. CRISPR-Cas9基因筛选
：混合慢病毒转导Huh-7.5-Cas9细胞，转导第2天加入稀释好的冠状病毒，感染2周后收集存活的细胞，分离纯化gDNA，PCR扩增gDNA，SPRI beads纯化与片段筛选，Illumina NexSeq 500平台测序。
7. siRNA阵列文库验证候选基因
：将Huh-7.5细胞铺于96孔细胞板中，转染siRNA 60h后加入冠状病毒，孵育24h后，进行免疫荧光测定
Screening result
：
核心CRISPR sgRNA慢病毒文库筛选结果显示，SCAP, HS2ST1, EIF42以及Rab家族中部分基因sgRNA富集，表明这些SARS-CoV-2蛋白互作子在病毒感染、诱导细胞死亡中起着重要的作用。且富集的sgRNA大多隶属于safe-targeting sgRNA，在没有病毒感染的情况下敲除这些基因不会对细胞活性造成影响，因此，可作为SARS-CoV-2治疗的候选靶点。
同时，通过定制siRNA阵列文库进行CRISPR筛选结果验证，敲低相关宿主因子表达会明显减弱病毒感染，进一步证明了CRISPR筛选结果的稳健性。
Discussion
： 此研究借助自定义寡核苷酸池，设计生成核心sgRNA文库，进行CRISPR混合病毒深度筛选，与全基因组CRISPR广泛筛选相比，其优点为：1）增加序列覆盖度——每个基因设计10个sgRNA；2）应用多重筛选条件——不同类型的冠状病毒、温度等；3）提高信噪比——排除主导筛选结果的sgRNA靶向基因。最终，通过多种功能性读值验证全基因组CRISPR筛选中遗漏的的关键宿主因子。综上，此研究提出了一种通用的筛选方法来探索宿主与病原体之间蛋白与蛋白互作网络以及功能基因组学，为抗病毒策略提供候选靶点。
文献好物推荐
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T-2004-02链接：
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Reference:
Hoffmann HH, Sánchez-Rivera FJ, Schneider WM, et al. Functional interrogation of a SARS-CoV-2 host protein interactome identifies unique and shared coronavirus host factors. Cell Host Microbe. 2021;29(2):267-280.e5. doi:10.1016/j.chom.2020.12.009
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