Touchdown PCR入门和5个关键技巧

非特异性扩增的问题

 PCR 可能而且经常会遇到非特异性扩增等问题。 错误引物，其中引物结合 DNA 模板中的非特异性序列，导致 DNA 聚合酶扩增错误的模板 DNA 序列，是 PCR 后凝胶上非特异性条带的原因之一。

如何消除 PCR 中的非特异性扩增

仔细设计 PCR 引物有助于减少脱靶结合的变化，尽管所需目标 DNA 的序列确实限制了选择。 通过测试各种退火温度和其他条件来优化 PCR 条件是一种方法，另一种是使用Touchdown PCR。

什么是Touchdown PCR？

Touchdown PCR 是对 PCR 的一种改进，用于帮助减少非特异性退火和扩增。 初始退火温度设置为高于引物的最佳熔化温度 (Tm)，然后在后续循环中逐渐降低，直到达到 Tm 或“着陆温度”，就像飞机在跑道上着陆一样（图 1 ).

图 1：Touchdown PCR 循环的表示以及退火温度的变化。

在循环过程中将温度逐渐降低到更允许的退火温度有利于所需扩增子的扩增。

Touchdown PCR 的优点

在所有类型的 PCR 中，确定最佳退火温度至关重要。

通过在初始循环中使用高于计算的 Tm 的温度，Touchdown PCR 有利于引物-模板互补性最高的扩增子的积累。在随后的循环中逐步过渡到较低的温度，通过在反应中使用所需的扩增子来防止较低的产量，这些扩增子现在胜过任何非特异性产物或引物二聚体。

Touchdown PCR 的五个关键技巧

1. 保持反应冷静

在热循环开始之前保持所有反应低温对于避免非特异性启动至关重要，即使是使用TouchdownPCR。

2.使用热启动设置

一旦您的反应准备就绪，最好使用热启动设置，进一步减少初始循环期间的非特异性相互作用。

3.考虑添加剂

如果使用Touchdown PCR 时仍然遇到问题，请考虑将其与添加剂结合使用。

4. 保持低周期数

太多循环会导致凝胶中出现非特异性条带，表明非特异性扩增。为限制这种情况，请将 PCR 扩增循环的总数保持在 35 以下。

5. 添加一个额外的变性循环

在 96°C 或 97°C 下额外 1 分钟的变性循环对于困难的模板可能非常有用。

简而言之，降温 PCR 是一种通过从高退火温度开始并在 PCR 循环中缓慢降低退火温度直至达到所需退火温度来限制非特异性扩增的技术。可以使用TD PCR 来克服非特异性扩增和引物二聚体形成的问题。